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【摘要】目的：探讨改进新生鼠脑缺氧缺血损伤模型，降低传统制模方法中实验鼠的死亡率。方法：7日龄SD新生乳鼠乙醚吸入麻醉后双线永久性结扎左侧颈总动脉，恢复2 h后置于缺氧箱中，输入氮氧混合气体维持缺氧舱内氧浓度（12±0.1）%，持续缺氧1h±10min。比较建模过程中三组实验鼠的存活情况;光镜下观察建模后1d、3 d、7d三组实验鼠左侧大脑半球的病理变化情况。结果：正常组未见实验鼠死亡，传统组制模中10只死亡，改进组1只死亡。脑组织病理检测传统组与改进组病理变化差异无明显性，改进组与正常组差异有显著性。结论：本研究改进了传统的建模方法，在确保模型制备成功的基础上减少了实验鼠的死亡率。降低了实验成本，值得进一步论证及推广。
【关键词】缺血缺氧性脑损伤；动物模型
文章编号：1009-5519（2008）10-1434-02 中图分类号：R363 文献标识码：A
缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是威胁新生儿生命及导致神经后遗症的严重疾病。因此深入开展新生儿HIBD发病机制的研究，寻找有效的防治对策一直是国内外围生医学领域的重要课题[1]。在研究中怎样建立合适的HIBD动物模型就显得十分重要。本研究改进了传统的建模方法，在确保模型制备成功的基础上减少了实验鼠的死亡率，降低了实验成本。我们对这两种建模方法作一比较。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组：新生7 d SD乳鼠共56只，雌雄不限，体重12~16 g，由第四军医大学实验动物中心提供。在实验后续过程中均由体格健壮的母鼠带养。随机分为传统组和改进组与正常组，分别23只，23只，10只。
1.2 实验方法
1.2.1 传统组：以RICE方法制备HIBD乳鼠。7日龄SD乳鼠乙醚吸入麻醉后取仰卧位，四肢固定于小手术板上，酒精局部消毒后颈部正中切口，游离左侧颈总动脉，5/0丝线双线永久性结扎，缝合皮肤切口后反回母鼠笼中恢复2 h，而后置于37℃恒温水浴的1 L自制有机玻璃缺氧舱(20 cm×50 cm×10 cm有机玻璃舱，其一侧的近底部和对应一侧的近顶部各有一1 cm×1 cm小孔分别与氮氧混合气源、测氧仪连接)中，以1~2 L/min的速度输入氧浓度为8%±0.1%的氮氧混合气体，持续缺氧2 h，氧浓度以CY-100便携式数字测氧仪(浙江省建德市利达仪器厂)监测。实验结束标记后立刻置于母鼠旁。
1.2.2 改进组：在总结以往预实验的经验后，升高缺氧舱内氧浓度，缩短缺氧时间减少了实验过程中动物死亡率，具体方法：7日龄SD乳鼠乙醚吸入麻醉后取仰卧位，四肢固定于小手术板上，酒精局部消毒后颈部正中切口，游离左侧颈总动脉，5/0丝线双线永久性结扎，缝合皮肤切口后反回母鼠笼中恢复2 h，而后置于37℃恒温水浴的1 L自制有机玻璃缺氧舱，输入氮氧混合气体维持缺氧舱内氧浓度12%±0.1%，持续缺氧1h±10min（具体时间依照实验中动物出现的神经行为严重情况而定），实验结束标记后立刻置于母鼠旁。
1.2.3 正常组：10只实验鼠不作任何处理。
1.3 神经行为观察：观察实验鼠有否烦躁、惊厥、昏迷等意识状况及皮肤黏膜色泽变化。
1.4 病理学检测; 各组各时间点（1 d、3 d、7 d）分别取实验鼠，经10%水合氯醛（40 mg/100 g）腹腔注射麻醉后，开胸暴露心脏，剪开右心耳，经左心室插管至主动脉内，相继快速灌注肝素化生理盐水20 ml、4%多聚甲醛20 ml，再以4%多聚甲醛50 ml 2 h内缓慢滴入，断头取全脑，去除脑膜，取中1/3脑组织冠状切块，进行固定、浸蜡、包埋、切片，观测损伤后不同时间脑组织的病理变化情况[2]。
2 结果
2.1 实验动物死亡率：传统组10只乳鼠均死亡（8只乳鼠于缺氧过程中死亡，2只乳鼠于后续喂养中死亡），改进组有1只乳鼠于动脉结扎时死亡，正常对照组无乳鼠死亡（见表1）。
2.2 病理学检测结果：光镜下可见正常对照组大脑组织各部位结构及细胞层次清楚，细胞形态结构清晰完整，核仁清楚；HIBD传统组与改进组左侧脑组织损伤严重，镜下可见神经细胞变性、坏死、崩解，表现为组织结构不清、细胞肿胀、核膜、核仁不清，有的细胞内容物释放，仅留下一细胞轮廓，并有炎症细胞浸润（见图1、2）。镜下还可见部分凋亡的神经细胞，表现为细胞皱缩变圆，与邻近细胞脱离接触，核固缩变圆，胞浆深染[3]。
3 讨论
HIBD大鼠模型的建立对于深入研究新生儿HIBD的发病机制、预防和治疗有着重要的意义。以往多是采用RICE方法制作模型。但笔者在实验时发现动物死亡率过高。在以往的研究中，也有将实验鼠动脉结扎前不予麻醉，并且术后动物不作休息，立即进行缺氧来进行模型制备的方法[4]，但我们认为此法有两点不可取：其一，对于手术前的麻醉起到了制动和镇痛作用，一方面从伦理学上符合实验动物的管理要求更重要的是避免了动物严重的应激反应而影响实验结果。其二对于术后动物不作休息立即进行缺氧，频繁增加了开箱频率，同时对于鼠的放入先后顺序不好控制，易导致实验鼠缺氧时间的不一致从而增加实验偏差。
本实验中传统RICE方法与改进方法制备的HIBD实验鼠模型有着一致的病理变化：两组在光学显微镜下可见病理改变以HIBD后24 h最为显著，神经元细胞肿胀变性、核固缩、核碎片，病变侵及皮层、海马、纹状体和丘脑等部位;72 h后病变开始减轻，部分区域可见胶质细胞增生。这说明两种方法都能确保建模的成功。但在传统建模方法过程中，尤其是实验鼠缺氧过程中出现了较高的死亡率43.5%，造成了较高的实验成本。而改进组中我们适当增高了缺氧箱内的氧浓度，由原来的8%±0.1%调高到12%±0.1%，同时根据实验鼠的神经行为变化情况（大部分实验鼠表现为缺氧缺血10~15 min后出现烦躁不安，20~30 min全身苍白、呼吸急促，随后活动明显减少、翻身能力降低或消失，随即出现肢体的抖动、惊厥及嗜睡等意识障碍）当出现20~30 min的昏迷状况后停止缺氧。把原来2 h的缺氧时间缩短为1h±10min。因此在改进组中实验鼠死亡率降低到4.3%，大大减少了实验费用的不必要损耗。对于此种制备HIBD大鼠方法的合理性，有效性还可以通过更进一步的实验方法进行证实，例如脑血流量的测定，电镜下微细结构的观察，系列生化指标的检测等。
参考文献：
[1] Glass HC，Ferriero DM.Treatment of hypoxic-ischemic encephalopa-thy in newborns[J]. Curr Treat Options Neurol，2007，9(6):414.
[2] Kadam SD，Dudek FE.Neuropathogical features of a rat model for per-inatal hypoxic-ischemic encephalopathy with associated epilepsy[J].Comp Neurol，2007，505(6):716.
[3] 王 杨，宣桂华.新生大鼠脑缺氧缺血损伤模型的建立[J].安徽医科大学学报，2004，39（4）：259.
[4] 骆健明，庄明华，刘明发，等.两种新生儿缺血缺氧性脑病模型建模方法的比较[J].中国康复理论与实践，2005，11(7):548.
收稿日期：2008-01-30
