高增殖活性T细胞淋巴瘤【hTERT-siRNA对人肝癌细胞QGY增殖活性的影响】

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  【摘要】目的:利用siRNA在肝癌细胞内诱导RNAi,抑制hTERT基因表达,探讨RNAi对肝癌细胞增殖活性的影响。方法:构建靶向hTERT基因的siRNA(hTERT-siRNA),转导入肝癌细胞株QGY,采用3H-TdR掺入法检测转染质粒后细胞增殖活性。结果:成功构建hTERT-siRNA,其对肝癌细胞增殖具有明显抑制效应,抑制率达42%。结论:hTERT-siRNA能明显抑制肝癌细胞的增殖。
  【关键词】RNAi;肝细胞癌;hTERT
  文章编号:1009-5519(2008)23-3487-02 中图分类号:R73 文献标识码:A
  
  原发性肝癌是严重威胁人类健康的一种疾病,我国已成为世界上肝癌发病最集中的国家,每年新发病例约占全球的45%。目前对肝癌的治疗方法主要有外科手术疗法、经皮酒精注射、动脉栓塞、化疗等,但总的效果并不太理想。基因治疗是当今研究的热点,探索与肝癌发生、发展相关的基因为治疗靶点成为关键。
  已有研究发现,端粒酶的异常表达与恶性肿瘤的发生发展和预后密切相关[1]。端粒酶逆转录酶(humantelomerase reverse transcriptase,hTERT)是代表端粒酶活性的非常重要的标志物,它的表达与端粒酶活性具有一致性,hTERT基因在肝癌中的表达阳性率为89.5%[2]。研究表明hTERT的高表达能抑制细胞凋亡,导致细胞永生化[3]。本实验依据RNA干扰(RNA interference,RNAi)原理,使用短发夹样RNA设计的RNAi-DNA载体方法,以hTERT基因为靶点,构建稳定表达小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的肝癌QGY细胞株,探索hTERT siRNA对QGY细胞增殖活性的影响。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 材料
  1.1.1 细胞株:人肝癌QGY细胞株购自中科院上海细胞生物研究所。常规培养于含10%新生牛血清及青、链霉素的RPMI-1640培养液,37℃、5% CO2孵箱中培养。
  1.1.2 质粒:质粒pGenesil-1购自武汉晶赛生物工程技术有限公司。
  1.1.3 试剂:限制性内切酶BamH1、Hind III和EcoRI购自Takara公司,总RNA提取试剂、转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司;PCR试剂购自Takara公司;siRNA-hTERT转录模板由上海生工公司合成。
  1.2 pGenesil- hTERT-siRNA质粒构建:shRNA发夹结构序列长度为65 bp,两端分别为BamH1、HindIII 酶切位点,中间为9 bp茎环序列分隔的反向重复靶序列,并以6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。质粒构建采用BamH1、HindIII双酶切空质粒pGenesil-1,将shRNA-hTERT转录模板5"-AAGTGTCACAGCCTGTTTCTG-3"和阴性对照转录模板5"-AAGCTTCATAAGGCGCATAGC-3"(与人基因无同源性)分别设计成发夹结构,定向克隆至该载体上,经筛选、酶切鉴定后,进行测序确定,命名为pGenesil-A,阴性对照命名为pGenesil-B。
  1.3 质粒转染:采用LipofectamineTM2000脂质体转染法。转染前1天,换取无抗生素培养液,按5×103/孔接种96孔板,置37 ℃培养。待细胞增至90%~95%时,将细胞分为两组,每组12孔,按1∶4的质粒-脂质体复合物分别进行转染质粒pGenesil- A和pGenesil-B至细胞中。培养24 h后换G418选择培养液,继续培养12h后进行3H-TdR掺入法实验。
  1.4 3H-TdR掺入法检测转染质粒后细胞增殖活性:每孔加入3H-TdR 1μCi,继续培养12 h,PBS清洗、胰酶消化后,收集细胞至玻璃纤维滤纸。晾干后,加入装有闪烁液的闪烁瓶中用液体闪烁计数仪检测3H放射强度(cpm值)。
  1.5 统计学处理:cpm值以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS12.0软件包进行处理,两组组间差异比较采用t检验,P<0.05被视为有统计学意义。
  
  2 结果
  
  2.1 重组质粒的鉴定:质粒pGenesil-A和pGenesil-B经Hind III和EcoR I双酶切,同时做pGenesil-1空载体双酶切对照。1%琼脂糖电泳,pGenesil-1空载体经双酶切后呈2条带,分别为4.54 kb的载体片段和364 bp的小片段;而重组质粒则为4.54 kb的载体片段和425 bp的目的片段。测序结果均正确。
  2.2 细胞增殖活性检测:转染质粒pGenesil-A后QGY细胞的cpm值为56389±6243,转染阴性对照质粒pGenesil-B后QGY细胞的cpm值为98674±5418。与阴性对照质粒pGenesil-B比较,质粒pGenesil-A转染QGY细胞48h能够明显抑制肿瘤细胞增殖(P<0.01),抑制率达42%。证实hTERT的siRNA在体外抑制hTERT表达后,能抑制肿瘤细胞增殖,见图1。
  
  3 讨论
  
  端粒酶是一种核糖核蛋白酶,由RNA和蛋白质组成,具有逆转录酶的功能,能以自身的RNA为模板合成端粒DNA,从而维持端粒的长度。在正常人体细胞,端粒随细胞分裂而进行性缩短,当达到一定程度,细胞就衰老死亡。端粒酶的激活可使端粒长度保持相对稳定,从而使细胞获得永生化,进一步发生癌变,提示端粒酶的激活与恶性肿瘤发生、发展密切相关[4]。而端粒酶催化亚基 (hTERT)是端粒酶全酶活性的限速因素,与肝癌关系更为密切,hTERT基因在肝癌中的表达阳性率为89.5% 。特异性地抑制hTERT基因在肝癌细胞中的表达,有望成为新的肝癌基因治疗靶点。
  
  RNA干扰技术发展迅速,现已成为分子生物学研究的主要手段之一,已有众多研究探索其对肿瘤治疗的可行性[5]。本实验利用RNAi-DNA载体技术,以hTERT基因为靶点,成功构建hTERT基因的小干扰RNA,并首先研究hTERT siRNA对肝癌细胞QGY的增殖活性的影响。结果表明siRNA能显著抑制肝癌细胞QGY的增殖,抑制率达42%,提示hTERT与肝癌发生、发展关系密切。进一步探索以hTERT为靶点的基因治疗,将为肝癌基因治疗的临床应用开辟新的思路。
  
  参考文献:
  [1] Oh BK,Lee CH,Park C,et al.Telomerase regulation and progressive telomere shortening of rat hepatic stem-like epithelial cells during in vitro aging[J].Exp Cell Res,2004,298(2):445.
  [2] Takuma Y,Nouso K,Shiratori Y,et al.Telomerase reverse transcfip-tase gene amplification in hepatoeellular carcinoma[J].J Gas troen-terol Hepatol,2004,19(11):1300.
  [3] Akiyama M,Yamada O,Kanda N,et al.Telomerase overexpression in K562 leukemia cells protects against apoptosis by seruHl deprivalion and double-stranded DNA break inducing agents,butnotagainst DNA synthesis inhibitors[J].Cancer Lett,2002,178:187.
  [4] Shay JW,Van Der Haegen BA,Ying Y,et al. The frequency of im-mortalization of human fibroblasts and mammary epithelial cells tran-sfected with SV40 large T-antigen[J]. Exp Cell Res, 1993,209(1):45.
  [5] WaⅡNR,Shi Y.Small RNA:Can RNA interference be exploited for therapy[J].Lancet,2003,362:1401.
  收稿日期:2008-07-22

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本文来源:http://www.zhangdahai.com/gerenzongjie/xueshenggerengongzuozongjie/2019/0302/582.html

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