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【摘要】目的：探讨中药复方保肝宁对外源性瘦素(leptin)诱导的肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)增殖功能的影响及其保肝宁调控作用的可能机制。方法：给正常Wistar大鼠灌胃保肝宁煎剂7天，制备含药血清，用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolylium，MTT）检测保肝宁对leptin刺激HSC-LX2增殖的影响；应用蛋白印迹实验(Western blotting analysis)检测的P-JAK2蛋白表达水平。结果：保肝宁组作用HSC-LX2 6小时后，P-JAK2蛋白的表达水平开始降低，P-JAK2处于最低水平。与正常血清组比较，保肝宁组较秋水仙碱组更能降低P-JAK2蛋白表达水平。结论：中药复方保肝宁有阻断leptin诱导HSCs-LX2增殖的作用，而抑制P-JAK2蛋白的表达水平可能是其主要的机制之一。
【关键词】保肝宁；瘦素；肝星状细胞；P-JAK2
文章编号：1009-5519（2008）13-1897-02 中图分类号：R28 文献标识码：A
外源性瘦素（leptin）是由肥胖基因（obese gene）（位于人类染色体7q31.3)编码的一种167个氨基酸组成的分泌型蛋白质，是新发现的促肝纤维化的细胞因子[1]。最近研究显示，leptin具有诱导肝星状细胞（HSC）活化和增殖作用。leptin与肝纤维化具有密切关系，对其机制的研究已越来越受到关注[2]。由于国内外的研究尚处于起步阶段，因此探明保肝宁与leptin及肝纤维化的关系，可能有望成为揭示保肝宁抗肝纤维化机制新的切入点，对肝纤维化防治具有重要的临床和理论价值。本实验为进一步探讨中药复方保肝宁对一定浓度leptin刺激HSC-LX2增殖的抑制作用，并明确其产生抑制作用的信号传导途径和作用机理，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器：leptin购自protech公司，RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司，MTT购自广州普博公司，P-JAK2、HRP标记的山羊抗兔抗体及actin购自北京中山公司。
1.1.1 细胞培养：HSC-LX2由美国纽约西奈山医学中心Scott.Friedman教授馈赠。HSC-LX2以含10%胎牛血清的RPMI1640培养于含5% CO2饱和湿度的37 ℃环境中。
1.1.2 药物血清的制备：（1）煎煮中药：保肝宁的方药购自南方医院中药房，煎煮配制成1.77 g/ml，3.54 g/ml浓度的药液。秋水仙碱购自西双版纳制药厂，配制成0.05 g/ml的药液。（2）制备含药血清过程：wistar大鼠24只雌雄各半，体重200~230 g，清洁级，购自南方医科大学实验中心。随机分为4组：正常组、保肝宁等剂量组、保肝宁二倍剂量组、秋水仙碱含药血清组。除正常组给予相应剂量的生理盐水，其余各组每日按1 ml/100 g经胃灌药1次，连续7天。最后一次灌药（灌药前禁食不禁水12小时）1小时后，腹主动脉采血，离心分离血清，56℃水浴中灭活30分钟，0.44 ?滋m微孔滤膜过滤，-20 ℃冷藏备用。
1.2 MTT比色法：选择复苏后处于对数生长期的HSC-LX2，每孔0.5×104个细胞，37 ℃、5% CO2温箱中培养24小时后，弃去培养液，分别加入含100 ng/ml leptin的各组含药血清，每孔200 ?滋l，6孔重复。继续培养24小时后弃培养液，各孔加入20 ?滋l的MTT溶液混匀，37 ℃培养4小时后，小心吸去上清，于每孔加入200 ?滋l DMSO混匀室温下，将平板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，用酶标仪测定600 nm处光吸收值（OD），并计算增殖率（%）。
1.3 Western blotting analysis：按常规方法提取各组细胞蛋白，6%SDS-PAGE电泳，用Biorad微型电转移系统于4 ℃、60V电转移3小时至PVDF膜上。室温封闭1小时。一抗为兔P-JAK2蛋白多克隆抗体(1∶1000稀释)室温孵育1小时，二抗为HRP标记的山羊抗兔抗体(1∶2500稀释)在室温孵育1小时。应用化学发光试剂显色，曝光，X胶片经显影、拍照记录。
1.4 统计学处理：用SPSS10.0统计学软件分析及作表，OD值以x±s表示；采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 中药复方保肝宁对HSC-LX2细胞生长的影响：与正常血清组比较，保肝宁等剂量组、保肝宁二倍剂量组均能明显抑制HSC-LX2的增殖(P＜0.01)，秋水仙碱组亦能抑制HSC-LX2细胞的增殖(P＜0.01)；与秋水仙碱组比较，保肝宁等剂量组、保肝宁二倍剂量组明显抑制HSC-LX2的增殖(P＜0.01)，但保肝宁等剂量组与保肝宁二倍剂量组间差异无显著性，见表1。
2.2 中药复方保肝宁对P-JAK2表达的调控：保肝宁作用HSC-LX2 6小时后P-JAK2表达水平已开始降低，12小时后达到最低水平，至18、24小时，P-JAK2表达水平逐渐上升，但未恢复至原来未加保肝宁组水平（见图1）；与正常血清组比较，保肝宁组较秋水仙碱组更能降低P-JAK2表达水平（见图2）。
3 讨论
肝纤维化是肝脏纤维结缔组织异常增生的一种病理状态，是慢性肝病发展的必经阶段。它持续发展的中心环节在于肝细胞损伤或坏死引起的炎性反应不断刺激肝组织非实质细胞(主要是HSC)[2，3]，导致ECM各成份合成增多，而降解相对不足，二者失去动态平衡，致使ECM在体内过度沉积而引起肝纤维化。活化的HSC在肝损伤部位移行、增殖，在纤维性疤痕的形成中发挥关键作用，使肝脏炎症永久化，是肝纤维化形成过程中的中心环节[4]。故越来越多的抗纤维化药物研究选择HSC作为研究观察重点，活化的HSC被看成阻止肝纤维化进展的主要细胞靶标。1998年Potter在活化的HSC中发现leptin的mRNA和蛋白质后，人们开始关注leptin与肝脏疾病的关系[5]。目前国内外研究主要集中于leptin与活化HSC间的关系、leptin对细胞因子分泌的调控。
leptin主要的信号传递途径为JAK2-STAT3途径，JAK (justanother kinase，janus kinase)是一类酪氨酸激酶。JAK家族有7个高度保守结构域(JH)，无跨膜结构域。JH1-2具有催化功能，JH3-7中最保守的是JH4，中心的18个残基在整个家族成员中均相同，但它们无催化活性，可能在受体与JAK偶联过程中发挥作用，C端有2个功能区，即催化功能区和激酶相关功能区，N端在JAK与受体蛋白偶联的过程中发挥调节作用[6]，该家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK。JAKs的相对分子质量为12 000~14 000，四种亚型大约有1 000多个氨基酸组成。其中JAK1，JAK2和TYK分布广泛，而JAK3严格地分布于骨髓和淋巴细胞来源的细胞[7]。本研究结果显示，中药复方保肝宁有抑制leptin刺激的HSC的增殖并对其引起的JAK2-STAT3信号转导通路相关蛋白P-JAK2的作用。
现代医学研究肝纤维化的主要发病机理是肝组织中胶原合成与降解失衡所致的ECM大量沉积（津凝痰结），活化的HSC（肝络痹阻，血瘀痰结）是ECM的主要来源细胞，外源性leptin（内生邪毒）又具有诱导HSC活化和增殖的作用。在疾病状态时，邪毒内生，气血津液不畅，导致肝络痹阻，气滞血瘀，痰凝阻滞，反过来，津凝痰结的病理产物又影响气血津液的运行，加重病情的发展。因此，此时通络应遵循叶天士的“通补最宜”，虚实兼顾，标本兼治。通即化瘀化痰以疏通络道，软坚散结祛积，补是针对肝体阴用阳的特点，从肝肾同源，肾水涵木出发着重于养阴补肾。另外，HSC是慢性肝病中ECM的主要来源细胞，leptin引起的JAK2-STAT3通路又是HSC增殖的途径之一，因此，减少和抑制ECM的沉积、抑制HSC的增殖、阻断P-JAK2，即相当于减少中医的“痰瘀邪毒”形成。而保肝宁[8]由黄芪、柴胡、白芍、枳实等组成，具有疏肝健脾、活血化瘀、清热解毒、补肾、益气化痰的重要作用，其用药结合肝脏体阴用阳、忌刚喜柔、纯用活血化瘀易伤藏血之脏的特点，可能正是通过抑制有leptin刺激的HSC的增殖并对其引起的JAK2-STAT3信号转导通路相关蛋白P-JAK2这一作用起到抗肝纤维化的治疗作用
参考文献:
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[2] 王晓玲，刘 平，刘成海，等.拆方扶正化瘀方对肝细胞及肝星状细胞功能的影响[J].世界华人消化杂志，1999，7(8)：663.
[3] Liu P， Liu Ch，Wang HN，et al.Effect of salvianolic acid B on colla-gen production and mitogen-activated-protein kinase activity in rat hepatic stellate cells[J].ActaPhannacol Sin，2002，23:733.
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[5] Potter JJ，Womak L，Mezey E，et el.TransdifTerentiation of rat hepatic stellate cells results in leptin expression[J]. BiochemBiophysRes Commun，1998，244：178.
[6] Kisseleva T，Bhattacharya S，Braunstein J，et al.Signaling through the JAK/STAT pathway，recent advances and future challenges[J].Ciene，2002，285:1.
[7] Wilks AF，Harpar AG.Cytokine signal transduction and the JAK fam-ily of protein tyrosinekinases[J].Bio Essay，1994，16(5):313.
[8] 刘晓燕，吕志平，张绪富，等.保肝宁对HSC中NF-kB影响的实验研究[J].陕西中医，2004，25（6）：569.
收稿日期：208-01-23
