[两种X染色质检查方法的比较]x染色质手绘图

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  【摘要】目的:探讨改进检测X染色质的方法。方法:以在校学生的口腔黏膜细胞为材料,分别用石炭酸复红染液直接涂片法和吉姆萨染液扣染法显示X染色质。结果:石炭酸复红染液染色直接涂片法操作简单,用时短,阳性检测率低;吉姆萨染液扣染法操作稍复杂,用时稍长,阳性检出率高,但由于课堂时间限制,中职学生的课堂教学中不易推广。讨论:应用改进的人类性染色质检测方法,可以准确检出性染色质。
  【关键词】方法;检测;性染色质;比较
  文章编号:1009-5519(2008)15-2248-02 中图分类号:R446 文献标识码:A
  
  中等职校《医学生物学》实验教学中一直沿用石炭酸复红直接涂片法(以下简称直接涂片法),阳性率不太理想,故近年借鉴改良后的吉姆萨染液扣染法(以下简称扣染法),阳性率明显提高,现将两种方法比较如下。
  
  1 实验材料及方法
  
  1.1 材料:选择本校一年级汉族女生(16~20岁)20例,取其颊部口腔黏膜细胞为标本。
  1.1.1 染色液配制:石炭酸复红染液的配制,A液:碱性复红(basic fuchsin) 0.3 g,95%酒精10 ml,B液:石炭酸5.0 g、蒸馏水95 ml;将碱性复红在研钵中研磨后,逐渐加入95%酒精,继续研磨使其溶解,配成A液。石炭酸溶解于水中,配成B液,混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释5~10倍使用,稀释液易变质失效,一次不宜多配[1]。
  1.1.2 吉姆萨染液的配制:将吉姆萨粉末1g先溶于少量甘油,在研钵内研磨30 min以上,至看不见颗粒为止,再将全部(66 ml)剩余甘油倒入,于56 ℃温箱内保温2 h。然后再加入甲醇(66 ml),搅匀后保存于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可长期保存,一般刚配制的母液染色效果欠佳,保存时间越长越好。临用时用pH 6.8的磷酸盐缓冲液稀释10倍。固定液(甲醇:冰醋酸=3:1),用时现配[2]。
  1.1.3 实验所需其他器材:显微镜、载玻片、盖玻片、烧杯、量筒、吸管、牙签、染色缸、擦镜纸、吸水纸、离心机以及盐酸试剂等。
  1.2 方法
  1.2.1 石炭酸复红染色直接涂片法:用牙签在女性口腔黏膜颊部刮取上皮细胞,均匀涂布于(只能向一个方向涂抹,尽量避免细胞被破坏)载玻片中央部位。应当把细胞核界限清楚的深层上皮细胞用作这些涂片。稍干后,放入3:1的甲醛、冰醋酸固定液中固定30 min。固定的标本经水冲洗后,在石炭酸复红染液中染5~10 min,再在95%乙醇中分色约半分钟,最后用中性树胶封片、镜检。
  1.2.2 吉姆萨扣染法:受检查者用清水漱口后,用牙签轻轻刮取两侧颊部内侧的黏膜,弃去第一次刮取到的黏膜细胞,在同一部位连续刮取数次,将刮取的细胞涮入装有生理盐水3 ml的刻度离心管中,以1000 r/min离心10 min,弃上清液,加入1 mol/L盐酸3 ml,用吸管将细胞团轻轻打散,制成悬液,37℃解离20 min,以1 000 r/min离心10 min,弃上清液。加入新配制的卡诺固定液(甲醇:冰醋酸,V:V=3:1)3 ml,用吸管将细胞团轻轻打散,制成悬液,室温下固定10 min,再次打散细胞团后,继续固定20 min,离心前将细胞打散,以1 000 r/min离心10 min,弃上清液,根据细胞多少加0.1~0.2 ml新配制的卡诺固定液,将细胞打散,制成悬液,用吸管取细胞悬液,滴于冰水浸过的载玻片上,自然晾干后染色、镜检。
  1.3 计数标准及方法:X染色质位于核膜内缘,是核内惟一浓染的、轮廓清楚的小体,呈小山丘形、扁平形或三角形、圆形等。形态相似但不依附于核膜内缘的不计数,凡核膜缺损、染色过深或细胞上有杂质附着,细胞核重叠等均不做计数;低倍镜下找到细胞集中而又均匀分散的细胞群,油镜下计数100个可计数细胞(可做为计数细胞的是细胞核较大,轮廓清楚完整,无缺损、皱褶,染色清晰。核质呈细网状或均匀的细颗粒状,无深染大颗粒及细菌污染),计算其中X染色质的阳性率。
  
  2 结果
  
  2.1 直接涂片法结果:制片时间短,约40 min,大多数个体细胞被浓染,且背景残留染液杂质较多,污染视野,减少了可计数细胞数量。个体细胞X染色质阳性率为12%~17%。在教学过程中由学生操作时,因主观原因致阳性检出率更低。
  2.2 扣染法结果:染色时间较长,95分钟左右,镜下可见细胞轮廓拉清楚,胞核胞浆对比明显,核质均匀,细胞背景材料杂质少,X染色质形态清晰,每个个体X染色质阳性率在17%~20%。
  
  3 讨论
  
  X染色质检查可用于判断细胞中X染色体数目,以此鉴定性别及性染色体异常的遗传性疾病。与核型分析相比具有快速、操作简便,所需仪器简单等优点,是比核型分析优先考虑的方法:直接涂片法染色时间短,制片时间短染色过程不易掌控,细胞不是染色过深,就是细胞核与细胞质对比不明显,可能是由于染液浓度过高或是染色时间不适所造成;且背景残留较多杂质,直接涂片致使细胞不易完全分开,有重叠细胞团,由于固定液挥发还致细胞被破坏较多,导致镜检和统计困难。学生在实验课上操作时,制片过程更不够仔细等主观原因致以上情况更严重,阳性检出率更低,据统计为10%~13%。扣染法增加了细胞解离过程,促进细胞松软,能够使细胞充分松散,不重叠;在高倍镜下观察,核质均匀,细胞质与细胞核区分明显,易于统计;固定过程在离心管中进行,减少了固定液挥发而导致的细胞破坏,细胞保持完整,染色时间易于控制,该法还减少染液杂质残留于核内及周围。
  
  参考文献:
  [1] 樊祥岩,杨廷忠.医学遗传学基础[M].江苏:江苏科学技术出版社,1999.77.
  [2] 王静颍,王 懿.医学遗传学基础[M].北京:科学出版社,2007.97.
  收稿日期:2008-03-26

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本文来源:http://www.zhangdahai.com/jiaoxueziyuan/xuexiaogongzuojihua/2019/0303/2089.html

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