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文章编号：1009-5519（2008）13-1994-02 中图分类号：R28 文献标识码：A 拉米夫定等核苷（酸）类似物长期治疗最重要的问题是基因突变导致耐药的产生。现就拉米夫定基因耐药检测方法及临床进展作一综述。
1 基因耐药检测方法
基因耐药是指乙肝病毒基因发生特定的突变，并在体外实验中证实与耐药有直接关系。HBV复制过程中一个显著特点是以RNA为中间体进行逆转录，这一个过程因其DNA多聚酶缺乏校对功能而易发生变异，其变异发生率比一般DNA病毒大约10，000倍，各种类型变异均可发生，各编码区亦均可发生变异，P区编码HBV DNA聚合酶，为拉米夫定作用靶点，其突变导致耐药的发生。常用的检测方法如下。
1.1 核苷酸序列测定：将PCR扩增与核酸序列分析技术结合，直接测定HBV DNA聚合酶基因序列，可以检测出多位点的变异，称为PCR-序列分析，简称直接测序。是分析病毒基因的金标准，其主要优点是可检测出新的变异株，这对服用过抗病毒药物治疗的患者检测出未知的耐药突变株特别重要。其不足之处在于很难检测突变株与野生株混合感染（突变病毒占30%仍较难检测）[1]。另外操作费时，费力，检测成本高，及检测结果分析技术难度较大等限制了其在大规模标本临床检测中的应用。现代DNA测序大都应用循环测序的技术，采用新型的超纯热稳定多聚酶，快速结合核苷酸，其方法简单易行，大大提高了测序的自动化程度，有望弥补既往测序方法的不足。
1.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）：限制性片段长度多态性（RFLP）技术的原理是PCR扩增目的DNA，扩增产物在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段，继之在电泳上形成不同长度的DNA片段条带。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可用此方法检测。其灵敏度和特异性好，且可以用于混合感染的检测。另外实验简单、快速，无需特殊仪器等特点，使之在大规模临床检验中应用广泛。不足之处在于对酶切条件要求较高，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量。Niesters等[2]用此方法检测1例拉米夫定治疗乙肝患者，检测到rtM204S及rtL180M混合感染，且当其占10%即可检测。国内Yang等[3]用此方法检测拉米夫定治疗DNA阴转阳的35例乙肝患者的HBV DNA，14个发生YMDD变异，其中4个YIDD，6个YVDD，1个YI/MDD，3个YI/VDD，证实适于快速检测HBV DNA多聚酶突变。
1.3 实时荧光PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而对起始模板定量及定性的分析。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。Ide等[4]用此方法检测24例拉米夫定治疗超过1年乙肝患者，13例发生YMDD变异，其中7个YIDD，4个YVDD，2个YIDD+YVDD，且变异发生频率及时间与HBVDNA 载量有关，证实可以有效的用于监测YMDD变异且可以估计变异出现时。Chieochansin等[5]证明PCR锁定核酸介导TaqMan探针方法可以灵敏特异快速的检测YMDD变异，且与PCR-RFLP方法相比，其检测混合感染更省时，更敏感。
1.4 DNA杂交：利用具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的原理，来检测目的基因序列。其特异性探针用放射性同位素或荧光分子标记。用标记的样品核酸（靶核酸）与未标记的固化探针DNA杂交故称为反向杂交.这个杂交类型的优点是一次杂交反应中可同时检测样品中几种不同的靶核酸。在此基础上开展的线性探针检测技术，可检测乙肝病毒的基因型、前C区变异、基本核心启动子(BCP)变异和多聚酶基因变异；其优点是即使只有5%的病毒变异，也可以检测出来，可以早期诊断病毒耐药；该检查方法的特异性、可重复性和灵敏度均较好；其缺点是只能检测已知的变异，如果要检测新的耐药变异株，需设计新的探针。
1.5 基因芯片：又称DNA芯片，或DNA微阵列，以特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针，利用核酸杂交即互补碱基配对原理与靶基因杂交，通过随后信号检测，对靶基因进行定性与定量分析。DNA芯片具有快速，高通量，平行检测优点，一个芯片可同时检测多个变异。HBV DNA芯片技术更强有力的分析HBV的基因，可复式扩增整个HBV基因，一个高密度的HBV芯片可检测多达200个变异株的151个位点及病毒基因型；其优点是可一次分析整个HBV基因序列，缺点与线性探针技术类似，只能分析已知的病毒株，对新的病毒株需设计新的相应的芯片。但毫无疑问，基因芯片技术作为一种新的技术必将在突变检测中发挥重要作用。Zhang等[6]研究表明基因芯片法可快速、有效地检测HBV特定位点突变株，可用于HBV突变的大规模筛查。Hyunjung等[7]用寡核苷酸芯片技术检测123个接受拉米夫定治疗患者血清标本，其YMDD变异与PCR-RFLP方法一致率96.7%，野生株rtL180及rtV207序列与直接测序法一致率100%，表明其可以可靠有效的检测乙肝抗病毒耐药突变。Tran等[8]进行欧洲多中心基因芯片技术检测HBV耐药突变及基因型研究，对170例乙肝患者170份血清标本进行151个位点的245个突变，20个缺失，2个插入及其基因型检测，表明其可以同时检测大量变异，作为一个极有价值的诊断方法为乙肝治疗提供重要信息。
2 临床进展
拉米夫定为最早用于临床慢性乙型肝炎抗病毒治疗的核苷（酸）类似物。自1998应用于临床治疗乙肝以来，展示了显著的抗病毒作用，可以迅速减少病毒载量，延缓向慢性肝病进展。然而其面临重要问题是长期治疗导致耐药突变的产生。与拉米夫定有关主要耐药变异主要位于P基因保守C区YMDD序列（rtM204I/V），且常伴有其上游的rtL180M突变。其主要突变形式：（1）rtM204I/V+rtL180M；（2）rtM204I；（3）rtV173L+rtL180M+rtM204V；（4）rtL80I+rtM204I；（5）rtQ215S+rtM204I/V±rtL180M；（6）rtI169T+rtV173L+rtL180M+rtM204V；（7）rtA181T；（8）rtT184S
+rtM204I/V±rtL180M；（9）rtM204S+rtL180M，其中一部分变异是作为补偿突变，增强病毒复制活性或耐药性，一部分变异会影响到随后治疗选择，发生耐药突变后其临床过程是多种多样的。拉米夫定治疗1年后基因型耐药发生率14%~32%，随治疗时间延长，耐药发生率增高，5年时耐药发生率60%~70%[9]，与耐药率上升的相关因素有长期持续治疗，治疗前血清HBV DNA高水平，治疗开始后仍有较多病毒残余[9]。Thompson等[10]研究表明前核心启动子突变、ALT基线水平、持续病毒血症可以独立的预测拉米夫定早期耐药。
参考文献：
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[9] Anna S，Lok F，Brian J. McMahon. A ASLDGuidenceon Chronic Hepatitis B[J].Hepatology，2007，24:508.
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收稿日期：2008-03-31
