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【摘要】目的：对SD乳鼠心肌细胞Ca2+在低温条件下进行实时动态观察，为建立低温下心肌细胞钙离子运动模型提供实验依据。方法：采用荧光技术分别于37 ℃，24 ℃环境中对分离培养的SD乳鼠心肌细胞胞内Ca2+进行动态观察。结果：心肌细胞在体外呈集落生长。正常条件下，集落中无钙波产生，集落细胞同步搏动；当在24 ℃的低温环境下，集落中个别细胞先发生钙波，随后集落细胞同步搏动。结论：低温下个别细胞产生的钙波可能对其所在集落细胞的同步搏动有诱导并维持其搏动的作用，这为研究心肌的起搏与传导提供了最简单的模型。
【关键词】心肌细胞；钙离子；钙波
文章编号：1009-5519（2008）23-3485-03 中图分类号：R37 文献标识码：A
低温麻醉是器官移植的有效手段，但低温麻醉产生的心温降低常会导致心搏停止、心室纤颤和严重的心律失常，这给低温麻醉和器官移植等临床应用带来了局限性。据报道，人和许多非冬眠哺乳动物心脏保持节律收缩的最低温度为20℃~28℃[1]。Ca2+对心肌细胞的搏动具有关键作用，细胞搏动的紊乱常表现为胞内Ca2+流的紊乱[2~6]。因此，在适度低温条件下对心肌细胞胞内Ca2+进行实时动态观察将具有重要意义。而目前，国内外此方面的报道甚少。近年来，随着高灵敏度探针flou-4/AM eater和激光扫描共焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）的运用，为胞内Ca2+的实时动态观察提供了可靠手段。本实验通过分离培养SD乳鼠心肌细胞，用Fluo-4钙离子探针标记后，于37 ℃、24 ℃环境温度中在LSCM下对胞内Ca2+运动进行实时观测，为建立低温下心肌细胞Ca2+运动模型提供基础，从而为探讨低温下的心肌细胞起搏机理提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器：SD乳鼠购自四川大学华西实验动物中心；粗制二型胶原酶购自Gibico公司；新生小牛血清，M199培养基，flou-4/AM eater Ca2+探针试剂盒均购自Invitrogen公司；taurine购自上海生工。
温度用自制标本槽控制，标本槽由塑制培养皿改制，皿内中央粘置环形玻璃管与低温循环水浴相连，用以控制温度。电子温度计的探头紧贴皿底放置，用以监视温度。环形玻璃管围成容积约0.5 ml的小室用于盛放溶液和细胞。
图像采集采用Leica公司TCS SP2型号LSCM，图像分析采用Leica公司图像分析软件。
1.2 实验方法
1.2.1 乳鼠心肌细胞的分离与培养：取出生3 d以内SD乳鼠5只（雌雄不限），无菌取出心脏，迅速置于冷的K-H缓冲液中[4]，去血迹，心包膜及心房组织。将心室组织剪成约1 mm3大小的碎块，再用K-H缓冲液反复洗涤3次后，用0.1%二型粗制胶原酶分3次消化心肌组织，每次约15 min，再用含5%新生小牛血清的M199培养基终止消化。收集消化后的细胞悬液800 g离心5 min。用含5%新生小牛血清的M199培养液重悬细胞，按照105个/ml的细胞浓度接种于30 mm培养皿中，置于37 ℃，5%CO2，95%相对湿度的细胞培养箱中培养，24 h首次换液，以后每2 d换液1次。每天用相差倒置显微镜对心肌细胞生长情况进行观察。
1.2.2 心肌细胞的fluo-4负载：取培养到第四天的细胞，用K-H缓冲液洗涤3次，然后避光加入含5 μmol/L fluo-4的K-H缓冲液，37 ℃孵育30 min。然后避光下用k-H缓冲液洗涤3次，加入含5%新生小牛血清的M199培养液，37 ℃培养约40 min后，置于LSCM进行观察。
1.2.3 荧光图像的采集及数据的处理：将负染后的心肌细胞置于LSCM下，分别于37 ℃和24 ℃的环境温度下，用488 nm激光激发，扫描模式为单次双向扫描，分辨率采用256×256像素模式，扫描时间为140 ms/帧。成像过程选用Leica公司出品的LSCM自带的分析软件进行计算完成。
2 结果
2.1 SD乳鼠心肌细胞的原代培养：心肌细胞刚接种时，呈圆形，无明显搏动。培养24h后细胞开始贴壁，贴壁细胞呈长梭型或多边形，少量细胞有不规则搏动（见图1）。随后，心肌细胞逐渐在瓶底表面铺展生长，成片细胞的收缩明显而有力，搏动频率为55~120次/分。培养到第四天时，心肌细胞成集落生长，每个集落细胞约10~45个细胞，呈放射状排列，相邻两个集落的细胞可能相连。一旦成片后，整个视野的细胞搏动出现同步化，搏动频率约79次/分（见图2）。
2.2 Ca2+的实时动态观察
2.2.1 正常温度下心肌细胞中Ca2+的动态观察：心肌细胞负载fluo-4后，可在LSCM下观察到心肌细胞胞质中Ca2+浓度变化随心肌细胞的搏动节律性变化（见图3）。在37 ℃正常环境温度下，心肌细胞搏动周期约为79次/分，且整个视野的心肌细胞同步搏动。
2.2.2 低温下心肌细胞中Ca2+的动态观察：在24℃低温环境下，细胞搏动频率逐渐降低。当心肌细胞搏动频率降为40次/分时，心肌细胞Ca2+运动开始出现钙波，即：Ca2+浓度在细胞的一端突然的增高，呈带状向细胞的另一端移动。当一个集落中一个心肌细胞出现钙波时，整个集落的其他细胞无Ca2+浓度的变化。图3为LSCM纪录的细胞内Ca2+浓度变化的部分影像，其中1～18帧为纪录的一个心肌细胞集落Ca2+变化的时间序列图，采集时间为每帧140 ms。图4是图3扫描区域的放大图，分别选定A，B，C， D四个细胞，按照所选细胞的平均荧光强度对时间作图进行分析（见图6）。图5为图4中细胞A的放大图，沿细胞长轴由下至上选择E，F，G三个区域，按每个区域的平均荧光强度对时间作图进行分析（见图7）。由上述图可见，在1~12帧时段，细胞A出现钙波，钙波传播方向由E区域经F传至G区域，3个区域出现Ca2+浓度最大值的时间分别在第四、五、六帧。此时，细胞B，C，D胞质里无Ca2+浓度变化，细胞也无搏动。在13~21帧时段，集落细胞同步搏动，即A，B，C，D 4个细胞在第十三帧时荧光强度同时增强，Ca2+浓度同时增高，当第十四帧时，这些细胞的Ca2+浓度都达到各自的最大值。对于A细胞而言，Ca2+浓度变化与发生钙波时明显不一样，E，G，F区域出现Ca2+浓度最大值的时间均在同一帧上。这说明，低温状态下，集落中某个心肌细胞产生的钙波可能诱导其周围细胞Ca2+浓度发生改变，导致周围细胞跟它发生同步搏动。
3 讨论
Ca2+作为体内重要第二信使是通过产生一系列Ca2+信号实现对细胞生理活动控制的[7~10]。Ca2+动态运动导致胞质Ca2+浓度变化，这种浓度变化可被细胞识别并促使细胞做出应答反应（如收缩，吞噬，分泌等）。长久以来，研究细胞Ca2+采用的是膜片钳技术，但膜片钳只能探测细胞膜两侧Ca2+分布，不能得到整个细胞Ca2+的运动情况。本实验通过具有高扫描速度的LSCM与具有高度灵敏度的活细胞Ca2+探针flou-4的联合应用，在实时获取心肌细胞Ca2+运动方面取得了良好的效果。
心温降低常会导致心室纤颤、心搏停止及严重的心律失常，这给低温麻醉和器官移植等临床应用带来了局限性。许多哺乳动物包括人在内心脏保持节律收缩的最低温度为20 ℃～28 ℃。本实验中，通过分别在37 ℃正常条件下和24 ℃低温条件下对心肌细胞Ca2+运动及细胞搏动的观察，我们发现，在24 ℃低温环境下，心肌细胞搏动频率逐渐降低，且Ca2+荧光强度也逐渐减弱，Ca2+浓度降低。当心肌细胞搏动频率降为40次/分时，某些心肌细胞产生了钙波，且这些钙波与同集落其他细胞的搏动存在一定的关联。当集落中某个细胞出现钙波时，此集落的其他细胞无Ca2+浓度变化也不产生搏动，只有在细胞出现钙波后，此集落的其他细胞才出现Ca2+浓度变化并产生搏动，且整个集落细胞搏动同步化。当破坏了集落中能发生钙波的细胞后，集落中的细胞很快就停止搏动。由此，我们认为，胞内Ca2+浓度变化与心肌细胞搏动相关，低温下个别细胞产生的钙波可能诱导并维持其所在集落的其他细胞的Ca2+浓度发生变化，使得整个集落细胞产生并维持同步搏动。这为研究心肌的起搏与传导提供了最简单的模型，其机理还有待进一步研究。
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收稿日期：2008-07-14 修回日期：2008-07-15
