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文章编号：1009-5519（2008）11-1648-03 中图分类号：R73 文献标识码：A 细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是正常机体细胞在受到生理和病理性刺激后出现的一种自发的死亡过程，是机体为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡[1]。凋亡不足时，易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫性疾病等。这个过程涉及到多个家族的蛋白质。目前证明Caspases蛋白酶家族在细胞凋亡的过程中起关键作用。本文就Caspases对大肠癌的影响综述如下。
1 Caspases蛋白酶及其生物学特性
1993年Yuan等[2]发现秀丽隐杆线虫的Ced-3基因与哺乳动物细胞ICE(interleukin-1 β converting enzyme)存在功能和序列上的高度同源，和Ced-3 一样ICE高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。目前在哺乳动物细胞中已发现有l4种ICE/Ced-3蛋白酶家族成员。该类蛋白酶具有以下特点：（1）均属于半胱氨酸蛋白酶；（2）均含有五肽保守序列QACRG；（3）均以无活性的酶前体形式合成；（4）活化后具有独特的催化活性，将底物在天冬氨酸位点后切断；（5）底物的特异性，即对底物序列的特异性识别，因而酶促反应具有高度特异性。以后根据它们的这些特点将之命名为半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteases)，简称Caspases。根据Caspases结构同源性、功能和底物特异性的不同， 可将其分为三大类。第一类为免疫反应组，包括Caspase-1，-4，-5，-13等；第二类为凋亡启动组，包括Caspase-2，-8，-9，-10；第三类为凋亡执行组，包括Caspase-3，-6，-7等。
Caspase家族广泛存在于细胞中，各成员分布和表达有一定的组织特异性。例如脑中有大量的Caspase-3t，少量Caspase-7存在，在子宫和胎盘中Caspase-l几乎无表达，而Caspase-4有较高的表达水平。Krajewska等[3]报道了Caspase-3在人体组织细胞中含量有明显差异。此外Caspase家族各成员常共存在于同一细胞中。人的JurkatT-细胞甚至含有该家族所有的已知成员，它们一般存在于细胞质中，偶尔也见于一些细胞核中。在正常状态下，它们以无活性的原酶形式存在，当凋亡信号刺激时，其特异性Asp被剪切，同时释放N-端结构域(Pro-domain)。所有的Caspases都在特异的Asp残基被剪切，一些上游的Caspases就能次序地激活其他下游的Caspases，形成Caspases级联反应，将凋亡信号一级级传至凋亡底物。Caspases通过对底物的作用引起的变化包括：（1）阻遏细胞周期循环；（2）破坏细胞平衡状态及修复机制；（3）使细胞从周围的组织结构中脱落；（4）使维持细胞结构的物质解体；（5）磷脂酰丝氨酸(PS)为其他细胞如巨噬细胞作包裹吞噬的标记[4]。
2 Caspases激活途径
Caspases的激活机制相当复杂，到目前为止其确切的激活机制仍不完全清楚。Mehmet[5]的研究表明，Caspases激活主要有以下三种途径。
2．1 线粒体依赖的途径：随着研究的深入，人们发现线粒体在细胞凋亡中发挥着重要的作用，而细胞色素C(cytochrome C，cytC)的释放是线粒体参与细胞凋亡的主要途径。Liu等[6]应用细胞游离的体外凋亡体系，发现3个蛋白Apaf-1(凋亡促进因子-1)、Apaf-2(细胞色素C)、Aapf-3 (Caspase-9)与凋亡有关。对Caspase-3激活除了需要dATP或ATP外必须有线粒体内膜的细胞色素C释放，线粒体参与凋亡转导的机制主要有两个方面：（1）线粒体质膜的渗透性改变，PT孔的开放使线粒体基质和胞浆内的离子得以平衡流动，使原来存在的线粒体跨膜电位(ΔΨm)被驱散。离子的流动有可能造成线粒体基质的高渗状态，从而使线粒体膨胀，细胞骨架蛋白受压，直接导致细胞凋亡的发生。（2） 线粒体的释放反应，线粒体内膜含有许多死亡促进因子(DPF)，包括细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)、促死亡蛋白、Caspase酶原等。Susin等[7]至少在某些细胞线粒体中发现Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9 的前体。 线粒体释放的细胞色素c能与Apaf-1及Caspase-9形成一个复合体，在dATP、ATP存在下活化Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等成员，使凋亡进行下去。线粒体自身也含有一定量的Caspase，通过单抗鉴定，Caspase-3前体有一种亚型，位于膜间隙，受凋亡信号刺激时会释放出来。线粒体内部释放的pro-caspase-3直接参与凋亡信号的转导。这样就有可能存在一个Caspase和线粒体自身反馈的环，凋亡刺激导致线粒体细胞色素C、AIF、Caspase释放，Caspase的活化又促进诱发这一过程，这对于凋亡的加速和凋亡信号传递有十分重要的意义。
2．2 死亡受体介导的途径：凋亡开始最具特征的路径之一是细胞死亡信号蛋白(TNF-2、RL、TRAIL和APo-3L)盘绕粘附到它的同源细胞表面的接受器上，从而将细胞外死亡信号通过死亡转入胞内。死亡受体是一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子（TNF）受体基因家族成员。目前发现至少有5种死亡受体c在细胞凋亡信号的传导过程中发挥作用，包括Fas分子(CD95或Apo-1)、TNFR-1（p55或CD120a）、DR3(WSL-l、TRAMP、LARD)、DR4和DR5(APC-2、TRAIL-R2)，在胞内部分都含有一个死亡域（death domin．DD），以此招募下游的凋亡蛋白。其中最具代表性的是死亡受体CD95。Fas分子的配体为FasL；TNFR-l配体为TNF-α；DR3为APO-3L，而DR4H和DR5配体为TRAL、APO-2。由于DD有相互积聚的倾向，死亡配体与其受体结合后导致其死亡结构域相互积聚并与转节器分子的死亡结构域相互结合，使死亡受体分子活化。死亡受体与转节器分子结合后导致细胞内Caspase酶原(pro-caspase)在局部聚集，通过转节器分子的另一端含有Caspase酶原分子相似的死亡效应器蛋白结构域相互串联结合构成大分子复合物，称为凋亡酶体(apoptosome)。凋亡酶体形成后其分子中的Caspase酶原(通常为pm-caspase-8)分子中的两个线形亚单位相互靠近，可以进行自身水解而成为具有水解活性的蛋白酶，然后可以依次水解其下游的同源酶(如procaspase-6．pro-caspase-7等)，最后激活其效应器酶(通常caspase-3)而导致细胞死亡。
2．3 内质网信号途径：内质网(endoplasmic reticulum，ER)信号途径是近年来研究发现的又一条重要的Caspases激活途径。内质网是细胞内蛋白质合成和折叠的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网主要通过对Ca2+的调控以及激活在它上面的凋亡相关酶来起作用。
Caspases介导的细胞凋亡是一种错综复杂的生理及病理现象，除上面所述的三种主要途径外， 还可能包含其他的激活方式，而且各种途径之间也并非完全孤立地发挥作用。例如除了上游Caspase可激活下游Caspase外，下游的Caspase同样可以激活上游Caspase，同时上游或下游的Caspase之间也可以相互激活， 使级联反应放大。细胞的最终命运就在于上述各种信号途径相互作用的结果。
3 Caspases的调控
3．1 线粒体水平的调控：表现在以下几个方面：（1）Bcl-2家族成员和凋亡调控：Bax和Bak的重新定位与线粒体外膜，被认为在细胞色素C 的释放中起重要作用。Bcl-2家族的其他成员如Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1能抑制细胞色素C的释放是早就知道的。最近研究证明Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1是通过抑制Bax的移位于线粒体外膜，而发挥抑制细胞凋亡作用的[8]。（2）SMAC/Diable由线粒体释放进入胞浆后，可与XIAP相结合，解除后者对Caspase-9的抑制。
3．2 死亡受体水平的调节：（1）死亡受体的上调：细胞的损伤，如放射线、化疗药物等可以导致DNA 的损伤，可以引起细胞表面Fas受体表达的上调，这一过程需要P53的介导[9]。（2）很多细胞表达FLIP(Flice-like inhibitory protein)，它有一个Caspase-8-like prodomain，但是缺少半胱氨酸活性位点。由于它竞争性抑制FADD/Pro-caspase-8，它的过表达会在受体水平上抑制凋亡[10]。
3．3 IAPS对Caspase的调控：IAPS是惟一内源性的Caspase效应酶抑制剂。已知IAPS家族成员有：NAIP、cIAP1、cIAP2、XIAP、Bruce、ILP-2、survivin和livin，它们能直接抑制Caspase-3，-7和-9的活化形式以及Caspase-9的前体。
3．4 蛋白激酶对Caspase的调控：P21与Caspase-3前体形成Caspase-3前体/P21复合物，从而抑制Caspase-3的活性。
4 Caspase与大肠癌
大肠癌是常见的恶性肿瘤，在欧美国家，发病率居恶性肿瘤的第二位。在我国，大肠癌发病率也居于恶性肿瘤的前列，且每年以4%的速度增加。近年来，由于分子生物学技术的发展，大肠癌发生发展的分子机制研究取得了突破性进展。大量研究表明其不仅与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关，还与细胞增殖和凋亡的失衡有着密切的关系。目前关于Caspase对其影响研究较多的主要有以下几种类型：
4．1 Caspase-3与大肠癌：Caspase-3是哺乳类动物细胞凋亡的关键蛋白酶，是凋亡执行的重要效应分子，它一般以23ku的无活性前体存在于细胞质中，当细胞进入凋亡时才被激活，参与多种因素诱导的细胞凋亡。Caspase-3在不同肿瘤组织中表达及意义存在差异，在肝细胞癌、胃癌[11，12]等多种肿瘤组织中的表达是明显降低的，提示Caspase-3的失表达在这些肿瘤的发生中起着重要的作用。最近有证据表明Caspase-3直接参与细胞核DNA 降解[13]。
陈文习等[14]利用S-P法检测48例大肠癌和l0例大肠腺瘤以及l5例正常大肠黏膜组织中caspase-3基因的蛋白和pkc-α表达，结果显示：两者在大肠癌中的阳性表达率显著低于正常大肠黏膜和腺瘤组织，且其阳性表达率与病理分级有关，分化程度由高到低，其表达率逐渐降低，提示Caspase-3、pkc-α在大肠癌中的失表达参与了大肠癌的发生及去分化过程。但pkc-α和Caspase-3蛋白在大肠癌中的表达无明显相关性，提示pkc-α作为抑癌基因在抑制癌细胞增殖和促进细胞凋亡机制中可能与Caspase-3并无协同作用。但关于pkc-α和Caspase-3在调控肿瘤细胞增殖与凋亡过程中的相关性已有报道。研究表明，MAPK家族的关键酶ERK1/2可以抑制Caspase-3的活性及其介导的细胞凋亡，而pkc-α的抑制子可以逆转这种抑制作用，提示pkc-α在ERK1/2和Caspase-3之间起着一定的链接作用[15]。另有研究发现，在通过抑制pkc-α活性诱导舌鳞状细胞癌凋亡过程中Caspase-3的表达活性是增强的[16]。这些结果表明，pkc-α作为癌基因时和Caspase-3在细胞的凋亡调控机制中可能存在一定的相关性。因此对于两者作为抑癌基因时在大肠癌发生发展中的相互关系仍需大量研究证实。
李铭等[17，18]关于Caspase-3与抑癌基因FHIT相关性的研究亦显示大肠癌组织中Caspase-3和FHIT的表达水平都下降，并且Caspase-3表达阳性组中FHIT 的阳性率57.5%显著高于Caspase-3阴性组中FHIT的阳性率10.5%，两者呈显著的正相关。国外学者研究发现用FHITcDNA封闭FHIT后，细胞中Caspase-3活性降低，并且细胞的凋亡水平下降，说明FHIT可以使Caspase-3表达上调，进而促进细胞发生凋亡。
4．2 Caspase-7与大肠癌：Palmerini等[19]发现caspase-7在结肠癌中表达下调，并将其作为一个新的生物学标志物。许多基础实验证实多种药物诱导肿瘤细胞凋亡是通过上调并活化caspase-7等凋亡分子而发挥细胞毒作用。Caspase-7作为细胞凋亡效应分子，一旦激活就意味着凋亡的发生。活化后通过切断与周围细胞的联系，重组细胞骨架、阻止DNA复制和修复、破坏DNA和核结构、诱导凋亡小体的形成等，促进细胞的凋亡，因此若能促进细胞表达caspase-7，则能导致肿瘤细胞凋亡，caspase-7有望成为肿瘤治疗的一个新靶点。
4．3 Caspase-8与大肠癌：Caspase-8基因与c-FLIP(cellular FLICE inhibitory protein)基因、caspase-10基因共同位于染色体2q33-34，由于mRNA的差异剪接，至少存在8种不同的异构体(isoforms)。Caspase-8广泛表达于各种成人组织，有报道多种人类肿瘤在该区存在杂合性缺失(LOH)，包括神经母细胞瘤(NB)、肺癌、头颈部癌、滤泡性甲状腺癌等。Caspase-8基因甲基化、基因突变及其它表达异常也与某些肿瘤、自身免疫性疾病的发生有关。Kim等[20]检测到结直肠癌中caspase-8基因突变(5.1％)，5个肿瘤来源的突变体中有3个表现出明显减弱的凋亡活性。
4．4 Caspase-9与大肠癌：线粒体释放的细胞色素C是诱导细胞凋亡的重要信号分子。细胞色素C从线粒体释放入胞质后，在dATP存在时与Apaf-1结合并激活Caspase-9，再激活Caspase-3而导致细胞凋亡。PARP的裂解激活是细胞凋亡最具特征性的分子标志。张桂英等[21]的研究结果显示，塞来昔布在诱导结肠癌HT-29细胞凋亡过程中伴有细胞色素C蛋白表达上调；作为细胞色素C的下游信号――Caspase-9前体蛋白表达下调，裂解活化增强；而细胞凋亡最直接的分子标志――PARP前体蛋白同样表达下调，裂解活化增强，三者均呈药物浓度依赖性，上述结果提示，塞来昔布诱导HT-29细胞凋亡的信号转导通路与“细胞色素c―Caspase-9-PARP”信号转导途径的激活相关。
除Caspase-3，7，8，9外，Caspase凋亡通路中其他组分与大肠癌的相关性及Caspase通路对大肠癌的具体作用机制还需要进一步研究。
5 小结
正是由于Caspases在细胞凋亡机制中的重要作用及其特性，针对它们来进行凋亡保护以及凋亡调控机制的研究日益广泛，如Bcl-2家族、IAPS、FLIP等对于大肠癌的影响及与Caspase的相关性研究都在进行中。Yagihashi等[22]培养了结肠癌细胞系(HT-29，SW480，SW620，and LSI180)用目前常用的方法对IAPS中的Livin mRNA进行定量检测，结果显示结肠癌细胞系HT-29(livin mRNA：GAPDHmRNA-0．42)高表达，其他两种结肠癌(LSI180 and SW620)没有检测到。郑爱秋等[23]的实验研究发现，大肠癌中Survivin的表达与Caspase-3蛋白的表达呈负相关，证实了Survivin可通过Caspase-3抑制的激活，从而阻止细胞凋亡。对Caspases在细胞凋亡过程中所起作用的更深入研究是选择对不同Caspases具有高活性、高选择性的抑制剂。只有找到合适的Caspases抑制剂，才能进一步从分子水平上阐明细胞凋亡的合理机制，进而发现新药，达到治疗和控制这一类疾病的目的。现今的研究已证实很多药物诱导的肿瘤细胞凋亡有Caspase的参与，因此，有人设想在使用抗癌药促进肿瘤细胞凋亡的同时，把Caspase抑制剂特定转移到正常组织，使正常组织细胞免遭凋亡，减轻对正常组织的毒副作用。随着细胞凋亡及抗凋亡机制的深入研究，将会在大肠癌的诊断和治疗方面发挥更大的作用。
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收稿日期：2008-01-02 修回日期：2008-03-03
