【www.zhangdahai.com--毕业生自我鉴定】
郭雪艳，蔺敏，刘贵生，金燕，阎春英，高淑娟#
1陕西省人民医院消化内科，西安 710068
2宝鸡市人民医院呼吸内科，陕西 宝鸡 721000
胃癌是消化系统发病率和病死率最高的恶性肿瘤，2020年全球癌症统计数据显示，全球新增胃癌患者108.9万例，病死76.9万例，亚洲约占50%[1]。胃癌已成为全球肿瘤的第三大死亡原因，中国是胃癌的高发国家，发病例数占全球的44.1%[1]。胃癌发生发展及多药耐药是非常复杂的过程，研究表明，多种分子参与了胃癌恶性表型及多药耐药网络的形成。TWIST作为bHLH转录因子超家族的成员之一，现已被多种研究证实为癌基因。前期研究发现，TWIST在胃癌组织及细胞中高表达[2]，且在人胃癌耐药细胞SGC7901/VCR中表达水平更高，可能与胃癌患者的多药耐药有关，参与了肿瘤细胞的浸润和转移过程[3]，但具体的分子机制不详。本研究采用基因克隆技术及基因重组技术从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中克隆了人TWIST基因的全长序列，合成可在真核细胞中高表达的重组慢病毒载体，构建高浓度精确表达TWIST的慢病毒载体，为后续研究TWIST在胃癌多药耐药、转移中的分子机制提供依据，现报道如下。
1.1 细胞和主要试剂
E.coli DH5a感受态细胞、293T细胞、GV341慢病毒表达载体及AgeI/NheI酶切均购自上海吉凯基因化学技术有限公司，胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR由第四军医大学肿瘤重点实验室聂勇战教授惠赠。总RNA提取试剂盒、包装载体纯化试剂盒均购自德国Qiagen公司，逆转录试剂盒、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒、Plasmid抽提Kit均购自美国普洛麦格公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，In-Fusion™PCR Cloning Kit购自美国康迪泰克公司，1 kp DNA Ladder Marker购自美国Fermentas公司，250 bp DNA Ladder Marker、Primer均购自上海捷瑞生物工程有限公司，琼脂糖购自赛百盛公司，Taq polymerase购自北京义翘神州科技股份有限公司，脱氧核糖核苷三磷酸（dexoyribonucleoside triphosphate，dNTP）购自日本Takara公司，限制性内切酶购自美国New England Biolabs公司，台盼蓝购自上海捷倍思基因技术有限公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胎牛血清均购自上海微科生化试剂有限公司，DMEM培养基、RPMI 1640培养基均购自美国Gibco公司，脂质体2000购自美国Invitrogen公司，Flag单克隆抗体购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗购自美国Santa Cruzigma公司，ECL-PLUS/Kit购自Amersham公司。
1.2 重组慢病毒表达载体GV341-TWIST的构建
1.2.1 载体酶切 选用高效慢病毒表达载体GV341，元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin，克隆位点：AgeI/Nhe。
1.2.2 目的基因片段获取 参考Genbank的TWIST1（BC036704）基因序列设计一对TWIST全基因扩增序列，上游引物5"-CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGATGCAGGACGTGTCCAG-3"，下游引物5"-AATGCCAACTCTGAGCTTGTGGGACGCGGACATGGAC-3"，其中交换配对碱基、酶切位点、用于PCR钓取的目的基因5"端部分序列，由上海吉凯生物化学公司合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）法纯化引物。PCR反应：94℃预变性5 min，55℃30 s，72 ℃ 2 min，再延伸 10 min，共 30个循环，TWIST PCR产物-20℃保存待检。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并使用凝胶回收试剂盒回收纯化目的条带。
1.2.3 重组质粒构建及鉴定 将纯化后的TWIST PCR产物及酶切后线性载体DNA、In-Fusion交换酶、10×In-Fusion交换酶缓冲液、ddH2O加入反应体系，反应条件：25℃水浴30 min，42℃水浴5 min中止反应，目的是将TWIST PCR产物交换入线性化表达载体。以ddH2O为阴性对照，以空载体为空载体自连对照，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为阳性对照。完成后再以上游引物5"-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3"、下游引物 5"-CAACCGAGAAGGCGTAGC-3"序列进行PCR扩增，得到阳性转化子PCR产物，并将其送往上海吉凯生物化学有限公司进行测序以鉴定基因的准确性。
1.3 重组慢病毒载体GV341-TWIST的表达及病毒滴度检测
1.3.1 293T细胞转染 选择生长状态良好的293T细胞进行传代培养，当细胞密度达到70%～80%时，将细胞培养基更换为无血清培养基；
将阳性转化子PCR克隆产物（DNA）与相应体积的Opti-MEM混合均匀，将 100 μl脂质体 2000 加入至 2.4 ml的Opti-MEM减血清培养基中，在室温条件下孵育5 min后将两者的混合液混合，然后静置20 min形成DNA与脂质体2000稀释液的转染复合物，移至293T细胞培养液中，37℃、5% CO2培养箱中培养细胞；
8 h后倒去含有转染混合物的培养基，加入20 ml的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤残余的转染混合物，弃去；
加入含10%血清的细胞培养基25 ml，37℃、5% CO2培养箱培养48 h后收集细胞上清，4℃、4000 r/min离心10 min，去除细胞碎片，过滤、离心后收集病毒浓缩液，-80℃贮存。
1.3.2 蛋白质印迹法（Western blot）检测TWIST蛋白的表达水平 分别收集转染和未转染GV341-TWIST的293T细胞，离心沉淀后使用超声破碎，使蛋白变性；
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转移到硝酸纤维素膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h后，加入Flag一抗（稀释浓度为1∶3000）4℃孵育过夜。TBST冲洗3次，每次10 min，加入羊抗鼠IgG的二抗（1∶4000稀释）室温孵育1 h，TBST冲洗3次，每次10 min，加入发光液，凝胶成像仪成像。
1.3.3 实时PCR 检测重组慢病毒载体GV341-TWIST 病毒滴度 收集感染和未感染重组慢病毒载体GV341-TWIST的293T细胞，提取总RNA，逆转录得到互补DNA（complementary DNA，cDNA），用于扩增WRPE（WRPE是慢病毒的元件之一，可以作为实时PCR检测的目标基因从而进行慢病毒感染样品的检测）的引物序列：上游引物5"-AATTCCGTGGTGTTGTCG-3"，下游引物 5"-AAGGTCCGCTGGATTGAG-3"，被扩增片段位置371～493 bp；
对照Actin引物（NM_001101）序列：上游引物5"-GTGGACATCCGCAAAGAC-3"，下 游 引 物 5"-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3"，被扩增片段位置932～1233 bp。PCR反应体系为20.0 μl，包括SYBR缓冲液 10 μl，上下游引物各 1.0 μl，cDNA 1.0 μl，ddH2O 7.0 μl；
反应条件：95 ℃预变性15 s，95 ℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环。反应结束后建立熔解曲线（反应条件：95℃1 min，冷却至55℃，从55℃开始到95℃，每次增加0.5℃，30 s增加一次）。反转录得到20 μl cDNA，取1 μl用于实时定量逐孔稀释测定Ct值，根据各组Ct值计算滴度，这一结果表示1/20样品的情况，滴度计算时再乘以20。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件对所有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；
以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 TWIST 基因片段的获取
从高表达TWIST的人胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中克隆，扩增TWIST基因编码区全序列的DNA片段，其片段大小约为651 bp，酶切后电泳，在651 bp处可见载体酶切产物特异性条带。（图 1）
图1 TWISTPCR产物电泳图
2.2 重组慢病毒表达载体GV341-TWIST的构建
将TWIST PCR产物交换入线性化表达载体进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳，阳性转化子PCR产物大小为706 bp（图2）。阳性克隆测序结果显示，重组质粒中插入的TWIST序列与Genbank中的序列完全一致。
图2 阳性转化子PCR产物电泳图
2.3 重组慢病毒表达载体GV341-TWIST转染293T 细胞
将重组慢病毒表达载体GV341-TWIST转染入293T细胞48 h后，可见部分细胞融合，并出现多核复合体；
荧光显微镜下观察到感染病毒后细胞内大量绿色荧光蛋白，转染率＞80%。（图3）
图3 重组慢病毒表达载体GV341-TWIST感染293T细胞后TWIST的表达情况（×200）
2.4 Western blot法检测TWIST蛋白的表达水平
重组慢病毒表达载体GV341-TWIST转染细胞在25 kD附近有大小与TWIST融合蛋白相吻合的特征条带，而阴性对照细胞不能检测到TWIST融合蛋白的表达。
2.5 实时PCR 测定病毒滴度
样品颜色同PCR曲线颜色，在本次滴度检测中，10-4μl组和对照样品间Ct值存在差异，认为在10-4μl组样品中存在病毒颗粒（图4A）。假定该组样品含有至少1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：1/（1.00E-04）×20=2.00E+5 TU/μl=2.00E+8 TU/ml。目的基因溶解曲线及Actin基因溶解曲线分别如图4B及图4C，图中没有出现杂峰，也未出现主峰异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。
图4 实时PCR测定TWIST 重组慢病毒滴度
随着日常生活环境的不断变化，细胞随着自身环境的变化也在不断更新自身结构功能，以更好适应现在所处条件或更好地与人类对抗。人类在不断研发胃癌新治疗方案的同时，人体细胞也在不断伪装包装自身，细胞形式各式各样，因此，不仅要加紧研发治疗方案，还要时刻监测细胞本身的变化。TWIST作为高度保守的碱性螺旋-环-螺旋转录因子，是于1983年在果蝇中发现的，其对果蝇胚胎发育的细胞重建及迁移具有重要作用[4]。随后在水蛭、文昌鱼、秀丽隐杆线虫、非洲蟾蜍、小鼠及人类细胞中相继发现了TWIST基因的同源物[5-10]。脊椎动物有TWIST1和TWIST2（也称之为dermo-1）2个蛋白[11]。
在正常生理情况下，TWIST主要表达于胚盘、胚胎中胚层和成年人的某些中胚层来源的未分化组织中。TWIST基因突变可导致Saethre-Chotzen综合征，是一种过早融合头骨的遗传性疾病，这一种遗传障碍表现为四肢异常、头和颜面不对称以及颅缝融合不成熟等[12-13]。研究发现，TWIST也在乳腺癌、肝细胞癌、肺癌、食管癌、胃癌、胆管癌、骨肉瘤、子宫内膜癌等多种肿瘤中表达上调[14-15]，并与患者的预后密切相关。本实验发现，TWIST在胃癌细胞及耐药SGC7901/VCR细胞中高表达，在胃癌发生发展中发挥原癌基因的作用，其表达还可促进胃癌细胞耐药及转移，目前具体分子机制尚不明确[16-17]。也有研究显示，TWIST可能通过促进上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）转化调节胚胎发育，对胚胎发育过程中的组织重建和细胞迁移能力有至关重要的调节作用[18]。TWIST具有EMT或肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）特征，是EMT和CSC所需的关键转录因子[19]。研究显示，TWIST将成为治疗肿瘤耐药性转移性的有效靶点[20]。Wang等[14]为探索TWIST与MDR基因相关蛋白之间的关系，构建了hTWIST cDNA的pcDNA5/FRT/TO载体，结果发现，TWIST可能通过调节MDR基因相关蛋白的表达来促进肿瘤细胞和组织的耐药性。
既往本研究组曾构建TWIST原核表达载体，但因其表达效率较低，影响后期功能实验[21]。因此，本研究从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出人TWIST基因，与GV341质粒酶切后成功构建TWIST重组慢病毒表达载体GV341-TWIST，将其转染至293T细胞，荧光显微镜下观察其转染效率＞80%，包装后获得滴度为2.00E+8 TU/ml的慢病毒载体；
通过Western blot检测发现TWIST蛋白在293T细胞中高表达。高效TWIST慢病毒表达载体的成功构建与成功包装可为TWIST在胃癌细胞高表达提供工具，为后期研究TWIST基因在肿瘤细胞发生、侵袭、转移中的作用机制奠定基础[22-23]。
综上所述，本研究成功构建并包装了TWIST慢病毒高效表达载体，为TWIST在肿瘤中的功能研究提供高表达工具。
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