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[摘要]目的：检测子宫内膜癌组织中血小板衍化生长因子(PDGF)及微血管密度的表达，为探讨子宫内膜癌的发病机制和子宫内膜癌的抗血管生成治疗提供理论依据。方法：用免疫组化染色方法和显微图像分析技术检测40例子宫内膜癌石蜡包埋组织、20例子宫内膜不典型增生组织及20例正常子宫内膜组织中PDGF及微血管密度的表达。结果：PDGF在正常内膜与子宫内膜不典型增生组织中的表达无明显差异(P>0.05)，而在子宫内膜癌中的表达要显著高于在正常内膜和不典型增生内膜中的表达(P0.05)，在高分化中的表达要低于在中、低分化中的表达(PO.05)。用spearman相关分析MVD与PDGF表达的关系，MVD与PDGF的相关系数为r=0.848(P=0.000)，MVD与PDGF成正相关。结论：PDGF在子宫内膜癌中的表达水平高于其在正常子宫内膜中的表达，且与MVD成正相关，说明其可能在子宫内膜癌的血管生成机制中起一定作用。其在中低分化中的表达无显著差异，且与肌层浸润无明显关系，说明可能在子宫内膜癌的早期发挥作用。
[关键词]子宫内膜癌；血管生成；免疫组织化学；血小板衍生生长因子
[中图分类号]R737，33
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721(2009)03(b)-009-03
子宫内膜癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一，近年来，发病率有上升趋势，已接近甚至超过宫颈癌的发病率，是威胁妇女生命健康的严重疾病。研究子宫内膜癌的发病机制，以期寻求有效的治疗方法已成为妇产科重要研究课题之一。
近年来，血管生成在肿瘤发生发展中的作用备受关注。研究表明，血管生成是肿瘤生长的先决条件，它为肿瘤组织提供氧气和营养物质。实体肿瘤在血管生成前只能生长到直径为1.0～1.3 mm大小，此时肿瘤的生长和死亡处于平衡，肿瘤呈休眠状态，但新生血管形成后，肿瘤细胞会呈指数增长。因此，抗血管生成治疗也成为肿瘤治疗研究的新热点。研究表明，肿瘤细胞可产生多种血管生长因子。其中血小板衍生生长因子(platelet-defived endothelia cell growth factor,PDGF)是血管生成领域相对较新的一个生长因子，它具有胸苷磷酸化酶活性，可促进内皮细胞DNA合成和增殖，在体外有趋化内皮细胞，体内诱导血管生成作用。PDGF在结肠癌、肺癌中均有促血管生成作用。微血管密度(microvessal density，MYD)是衡量肿瘤血管生成的定量指标，与多种肿瘤的预后有关。
文献报道，子宫内膜癌亦有血管生成活性。但是，目前在子宫内膜癌血管生成的研究中，关于PDGF的作用。国外报道较少，国内尚未见报道。本研究拟采用免疫组化的方法，研究子宫内膜癌中，PDGF蛋白的表达及其与血管生成之间的关系，为探讨子宫内膜癌的发病机制和子宫内膜癌的抗血管生成治疗提供重要的理论依据。
1材料与方法
1.1标本
选取中国医科大学附属盛京医院2002年1月～2006年12月手术切除的子宫内膜癌标本40例。患者年龄39-80岁，平均为59岁。按FIGO组织分化标准，40例全部为子宫内膜腺癌，高分化18例，中分化12例，低分化10例。子宫内膜不典型增生标本20例及正常子宫内膜标本20例为对照组。所有病例资料完整，手术前均未经放疗、化疗和激素治疗。
1.2试剂
鼠抗人CD34单克隆抗体(即用型)，鼠抗人PDGF单克隆抗体(即用型)，免疫组化sP试剂盒(即用型)，均购自博士德生物公司。
1.3方法
采用免疫组化S-P染色方法，即链霉素抗生物素蛋白一过氧化物酶连接法。
步骤：石蜡切片脱蜡至水，PBS冲洗(5 minx3次)，3％过氧化氢(10min)，PBS冲洗(5 min×3次)，正常山羊血清工作液封闭(10min)，滴加一抗(4℃过夜)，PBS冲洗(5 min×3次)，滴加生物素标记的二抗工作液(37℃，10 min)，PBS冲洗(5 min×3次)，滴加链霉索抗生物素蛋白一过氧化物酶溶液(37℃，10 min)，PBS冲洗(5 minx3次)，滴加DAB溶液，显微镜下观察3-10 min，自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封片、镜检。
1.4实验对照
阳性对照：分别以已知的PDGF阳性及CD34阳性的子宫内膜癌组织切片为阳性对照，结果为阳性。
阴性对照：用相同于一抗浓度的试剂盒内二抗代替一抗孵育切片，结果为阴性。
空白对照：用PBS代替一抗孵育切片，结果为阴性。
1.5结果判定
微血管密度(MVD)计数：参照Weidner报道的方法，每1个染成棕黄色的，可与周围血管，肿瘤细胞和其他结缔组织区分开来的内皮细胞或内皮细胞簇，均作为单一的、可计数的微血管，只要结构不相连续，分支结构也作为一个血管计数，不以红细胞的出现与否来确定微血管，也不以是否出现管腔来计数血管。管腔面积>8个红细胞直径，带有较厚的肌层的微血管均不计数。肿瘤内的硬化区域、肿瘤细胞稀少区域内的微血管不进行计数。先在100倍光镜下寻找肿瘤中血管密度最高的5个区域，然后在400倍镜下计数MVD，5个区域的均值为该肿瘤的MVD值。结果的判定在双盲法下进行且每张切片由两位不知临床资料及PDGF染色结果的高年资病理医师完成，分辨不清或染色模糊的细胞不计入计数，结果两人计数相差10％以上者重新计数。
PDGF结果判定：PDGF阳性染色为细胞浆或细胞核着色。400倍光镜下观察切片，数码相机采样，在400倍视野范围随机选择3-5个视野，输入显微图象分析系统，将阳性细胞的染色强度转变为量化指标，计算其平均光密度(opitaldensity，OD)值。
1.6统计方法
PDGF、MVD在组织中的定量统计采用SPSSl3.0软件包两个独立样本的t检验，以P 组织中的表达无明显差异(P>O.05)，而在子宫内膜癌中的表达要显著高于在正常内膜和不典型增生内膜中的表达。且有统计学意义(P0.05)，在高分化中的表达要低于在中、低分化中的表达，且有统计学意义(P0.05)。
2.3MVD与PDGF表达的关系
用spearman相关分析MVD与PDGF表达的关系，MVD与PDGF的相关系数为r=0.848(P=O.0001。MVD与PDGF成正相关。
3 讨论
肿瘤的血管生成是从已有的毛细血管网向肿瘤或在肿瘤组织内形成新的毛细血管。这些血管为日益扩增的原发肿瘤提供营养物质和氧气，肿瘤在生长过程中也分泌多种物质来促进新生毛细血管的进一步形成。大量证据已表明肿瘤生长是血管依赖性的。微血管密度(MVD)是衡量血管生成的定量指标，一般选择微血管密度最高的区域计数(即热点)，Weidner N等认为肿瘤组织内并非所有肿瘤细胞都具有血管生成活性，具有高血管生成能力的肿瘤细胞是肿瘤发生、转移的源头，进而决定了肿瘤的生物学行为和患者预后。因此有必要选择一些“热点”区域计数血管。研究中常利用某些特异性抗原染色内皮细胞来计数血管，如Ⅷ因子相关抗原、CD34和CD31。本研究采用CD34相关抗原标记血管内皮细胞来计数血管。
近年研究表明，人体多种肿瘤均有血管生成活性。如乳腺癌、肺癌、胃癌等，MVD为评估其预后的重要指标H。子宫内膜癌也具有血管生成作用。有学者将内膜癌接种到鸡胚绒毛膜尿囊或兔角膜时会诱导血管生成。本研究发现正常子宫内膜微血管密度显著低于癌变子宫内膜，也证明了此观点。Abulafia研究表明，在I期子宫内膜癌中，微血管密度显著高于正常内膜和复杂型增生内膜，且有肌层浸润，分化差者MVD比无肌层浸润，分化好者更高。在本研究中晚期、低分化者的MVD明显高于早期，高分化者，表明子宫内膜癌的浸润、进展与血管生成有关，与Abulafia的结果一致。在子宫内膜癌的治疗过程中，手术病理分期、分化程度，一直是临床医师指导治疗和判断预后的重要依据，因此，MVD对子宫内膜癌患者预后评估有重要参考价值。微血管密度与临床病理参数之间的关系在卵巢癌和前列腺癌中均有类似结果。
PDGF是从血小板裂解产物中发现的一种促血管生长因子，它能促进内皮细胞DNA合成，诱导血管的生成。已证实。它具有胸苷磷酸化酶活性，能可逆地使胸苷去磷酸化为胸腺嘧啶和2-脱氧核糖-1-磷酸，因此，许多学者把PDGF和胸苷磷酸化酶当作同一名词使用。其酶活性对PDGF促血管生成至关重要。它在多种肿瘤组织中的表达显著高于正常组织，并具有促进血管生成的作用。本研究结果显示在子宫内膜癌中PDGF的表达显著高于正常组，表明PDGF过表达可能对子宫内膜癌的发生起一定作用，推测PDGF可能是子宫内膜癌的一个促血管生成因子。
Seki等应用RT-PCR的方法研究了子宫内膜癌中PDGF的表达与临床病理参数和MVD之间的关系，发现PDGF mR―NA的表达与MVD有关，认为PDGF是子宫内膜癌的一个血管生成因子。Fujimoto等报道了其在子宫内膜癌I期和G1，侵犯肌层≤1／2的组织中高表达，认为PDGF的表达可能与子宫内膜癌的分化、侵犯肌层的程度和手术分期有关，在肿瘤血管增生早期阶段起重要作用，当肿瘤生长到一定大，则由其他的血管增生因子起作用。本研究结果表明PDGF在高分化中的表达要低于中低分化中的表达，但在中低分化中的表达无明显差异。在正常内膜与子宫内膜不典型增生中的表达无明显差异，但在子宫内膜癌中的表达明显升高。推测PDGF做为血管增生因子主要在子宫内膜癌的早期阶段起作用，当肿瘤生长到一定程度，则由其他血管增生因子起作用。PDGF在子宫内膜癌中的作用尚待进一步的研究。
总之，肿瘤的生长有赖于血管生成，血管生成又受到多种正负调节因子的影响，本研究结果提示，血管生成在子宫内膜癌发展中有较重要的作用，PDGF可能在子宫内膜癌的血管生成有促进作用，从而为确定子宫内膜癌血管生成的相关因素，提供了理论依据，随着肿瘤血管生成相关相关因素的深入研究，有助于设计和寻找有效的抗肿瘤药物，为子宫内膜癌的治疗提供新的思路和措施。
