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【摘要】 本研究以内皮细胞培养液（Endo?M）培养小鼠骨髓内皮细胞，探讨粒?巨噬系集落刺激因子（rmGM?CSF）对骨髓内皮细胞增殖的影响。用Endo?M培养小鼠骨髓内皮细胞，通过Wright?Giemsa染色计数内皮细胞集落、应用免疫荧光法观察内皮细胞表型；
加入不同浓度的GM?CSF，通过集落形成率、MTT法和流式细胞术检测内皮细胞生长周期，观察GM?CSF对内皮细胞体外扩增的影响。结果表明：
Endo?M诱导的骨髓细胞可以生成内皮细胞集落，vWF检测呈阳性；
集落形成率检测及MTT法测定均证实GM?CSF对内皮细胞的增殖具有明显的促进作用；
生长周期检测结果显示， GM?CSF处理组的细胞进入S期的比率为9.3%，而对照组为2.1%，说明GM?CSF可以通过促使内皮细胞进入S期而加快细胞的分裂，促进细胞增殖；
比较第1代和第4次传代后细胞的生长曲线，两者无明显差别，说明多次传代后的细胞仍保持传代早期的增殖潜能。结论：
GM?CSF对内皮细胞的增殖具有促进作用，经多次扩增传代后内皮细胞的增殖潜能无明显改变。
【关键词】 骨髓内皮细胞 GM?CSF 细胞增殖
Effects of Granulocyte?Macrophage Colony Stimulating Factor on Growth of Murine Bone Marrow Endothelial Cells
Abstract The purpose of this study was to investigate the effects of granulocyte?macrophage colony stimulating factor(GM?CSF) on the growth of mouse bone marrow endothelial cells. Endothelial cell culture medium（Endo?M）was used to culture murine bone marrow endothelial cells. Endothelial cell colonies were counted under microscope by Wright?Giemsa staining. The effect of different concentriation of GM?CSF on the proliferation of bone marrow endothelial cells was observed by the formation of endothelial cell colonies, MTT and flow cytometry. The results indicated that the endothelial specific marker vWF was expressed by the colony cells ,GM?CSF promoted the proliferation of bone marrow endothelial cell colonies and MTT confirmed the effect of GM?CSF on promoting the proliferation of bone marrow endothelial cells. The result of detecting cell cycle showed that the rate of cells entering into S phase was 9.3% in GM?CSF added group and the rate of cells entering into S phase was 2.1% in control. There was no significant difference in cell growth curve between the first passage and fourth passage. It is concluded that GM?CSF can promote the proliferation of bone marrow endothelial cells, the proliferation potential of bone marrow endothelial cells between the first and fourth passage no significantly changes.
Key words bone marrow endothelial cells; GM?CSF; proliferation
J Exp Hematol 2007; 15(3):622-625
目前，已有许多报道证明内皮细胞（endothelial cells, EC）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPC）可以用来治疗缺血性心脏病以及各种疾病引起的肢体缺血［1,2］也可以用于组织工程的血管构建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］报道，EPC对缺血心脏病进行治疗具有良好的效果，一方面减少了缺血组织的面积，同时改善了心脏的功能。Kalka等［5］则报道了利用EPC对肢体缺血的小鼠模型进行治疗，实验结果表明了EPC能显著增加缺血肢体的灌流，而且组织学检查发现缺血部位毛细血管的数目也大大增加。
内皮细胞的来源有多种， 可以从外周血、脐血及骨髓中获得［6］，而外周血中的内皮祖细胞来源于骨髓。从病人自体的骨髓中获得内皮细胞，一方面来源比较方便，而且也可以避免GVHD的发生。但是由于骨髓基质细胞种类多，难以分离纯化骨髓内皮细胞或内皮祖细胞。本研究用本实验室配制的内皮细胞培养液（Endo?M）体外培养小鼠骨髓细胞，分离纯化骨髓内皮细胞及内皮祖细胞，并观察粒?巨噬系集落刺激因子（rmGM?CSF）对小鼠骨髓内皮细胞体外增殖的影响以及体外增殖后内皮细胞增殖机能的改变，这对临床运用内皮细胞或内皮祖细胞治疗疾病有一定的指导意义。
动物
昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供，雌雄不限，普通饮食。
主要试剂和仪器
IMDM为Gibco公司产品；
新生牛血清购自杭州四季清生物制品研究所；
重组小鼠粒?巨噬细胞集落刺激因子（rmGM?CSF）为R&D公司产品；
vWF抗体、CY3标记的羊抗兔IgG为Sigma公司产品；
MTT、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；
酶标仪为Awarens公司产品；
CO2 培养箱购自美国Forma。
小鼠骨髓内皮细胞及内皮细胞集落的培养
用颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用IMDM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取1×106个小鼠骨髓单个核细胞种入1 ml含有15%新生牛血清的Endo?M 培养体系，置于24孔板中，于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养5天后,用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按每孔1×104个细胞种入24孔板，每组3孔。于二氧化碳培养箱内培养15天后计数内皮细胞集落数，以≥50个细胞的聚合计为1个集落。
内皮细胞的形态观察及vWF的检测
培养的骨髓内皮细胞集落经Wright?Giemsa染色后，显微镜下观察内皮细胞形态。用间接免疫荧光法检测骨髓内皮细胞vWF。将内皮细胞培养于24孔板内放置的盖玻片上，当细胞间没有明显的间隙时，取出盖玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封闭4小时，加入v WF抗体，4℃过夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3?IgG，37℃孵育60分钟,PBS洗3次：置于荧光显微镜下观察。以本室建的小鼠骨髓内皮细胞株［7］为阳性对照，骨髓成纤维细胞为阴性对照。
不同浓度的GM?CSF对小鼠骨髓内皮细胞形成集落的影响
取纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于24孔板中，每孔5 000个细胞，在基本培养体系（含1%浓度Endo?M）的基础上分别加入5、10、25 ng/ml的 rmGM?CSF，对照组不加入GM?CSF，每组3孔。置于CO2培养箱培养15天，于倒置显微镜下记数集落数，≥50个细胞的聚合计为1个内皮细胞集落。
GM?CSF对内皮细胞增殖影响的MTT法测定
将纯化的小鼠骨髓内皮细胞按5 000个/孔培养于96孔板，每孔0.2 ml，每组3孔。实验组培养体系中分别加入5、25、100 ng/ml的rmGM?CSF，对照组内不加。在37℃、5% CO2、饱和湿度下分别培养5天和10天，取出培养板吸去培养液，然后加入无血清的IMDM 180 μl和20 μl MTT溶液，放入培养箱孵育4小时，吸去液体，各孔加入DMSO 150 μl，振荡10分钟，使结晶充分溶解。选择492 nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值（OD492）。
生长曲线
纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于96孔板中，每孔5 000个细胞，加0.2 ml含15%新生牛血清的基本培养液，并加入25 ng/ml的rmGM?CSF。共种6组，每组3孔，培养5天后，分别于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后计数细胞，每次3孔，求平均值，做出生长曲线。按公式 DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代内皮细胞生长的倍增时间。
细胞周期的流式细胞术检测
无菌条件下取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2 ml培养体系中含15%新生牛血清的Endo?M），置于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入两种不同培养体系，对照组加含15%新生牛血清的IMDM，实验组加15%新生牛血清的IMDM和100 ng/ml的rmGM?CSF，每组各10孔，置于CO2培养箱培养3天后，用胰酶消化细胞， 200×g, 离心5分钟，用PBS洗涤细胞2次之后，用300 μl PBS重悬细胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）约700 μl（终浓度为70%），将细胞放于-20℃过夜处理后，用流式细胞仪检测细胞周期。
细胞传代培养
取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2 ml体系中含15%新生牛血清的Endo?M），置于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入15%新生牛血清的IMDM培养液和100 ng/ml的rmGM?CSF，促使细胞融合，再按1∶4传代于6孔板中，同样加入15%新生牛血清的IMDM和100 ng/ml的rmGM?CSF，等细胞生长至融合，按1∶4传代，加入相同培养体系。按上述方法传4代后，绘制生长曲线，方法同前。公式 DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代内皮细胞生长的倍增时间，并与第1代的倍增时间进行比较。
统计学处理
实验数据为3次结果，以mean±SD表示。不同处理组两组间比较采用t检验，应用SPSS软件分析，P<0.05表示有统计学意义。
结 果
细胞形态每孔种入小鼠骨髓内皮细胞5 000个，对照组加基础培养液,实验组在基础培养液的基础上分别加入rmGM?CSF 5、10、25 ng/ml。与对照组相比，实验组集落数均明显增多（图3），说明rmGM?CSF对小鼠骨髓内皮细胞的增殖有明显刺激作用。
rmGM?CSF对内皮细胞增殖的影响
小鼠骨髓内皮细胞培养5、10天，分别进行MTT的检测，结果表明rmGM?CSF对小鼠骨髓内皮细胞生长促进作用明显，各组与对照组相比差异显著（P<0.01） （图4）。
GM?CSF对EC细胞周期的影响
运用流式细胞仪检测细胞周期，观察GM?CSF对EC细胞周期的影响。结果显示GM?CSF使细胞进入S期的比例为9.3%，与对照组2.1%相比有明显差别。此结果说明GM?CSF能够促使细胞进入S期，加快细胞的分裂，从而促进了细胞的增殖（图5）。Figure 5. Effect of GM?CSF on cell cycle of endothelial cells. A: group treated by GM?CSF. B: control group.
体外扩增传代对内皮细胞增殖的影响
图6为小鼠骨髓第1代和第4代内皮细胞的生长曲线。利用计算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］计算出第1、4代细胞生长的倍增时间分别为30.25±0.55小时、31.67±0.26小时。第1代与第4代的细胞倍增时间相比，无明显差异，表明经体外扩增传代4次，仍能保持传代早期的增殖潜能。
Figure 6. Growth curve of the first and fourth passage generations of murine bone endothelial cells. 讨 论
国内外对于骨髓内皮细胞的纯化报道较少，但已经进行了一些关于细胞因子对内皮细胞增殖影响的研究，如Yonekura等［8］报道VEGF可以促进内皮细胞的增殖，Rieck等［9］则报道bFGF可促进角膜内皮细胞的生长。我们此前曾报道了VEGF、bFGF、SCF、IL?6、GM?CSF等对内皮细胞株的增殖有促进作用［10］。GM?CSF对未经转化的骨髓内皮细胞增殖的作用尚未见报道。本研究中，我们用本室配制的培养基在较短的时间内纯化了小鼠的骨髓内皮细胞，vWF为阳性，并在此基础上观察了GM?CSF对骨髓内皮细胞增殖的影响。应用基本培养基培养内皮细胞集落时，形成的集落数较少，加入rmGM?CSF后，集落生成明显增多。MTT的结果亦支持GM?CSF对小鼠骨髓内皮细胞生长的刺激作用。细胞生长曲线的结果表明，在含GM?CSF培养的条件下，内皮细胞生长的倍增时间为30.25±0.55小时，经4次传代后细胞倍增时间无明显延长，表明体外培养扩增4代后，细胞仍能保持早期的增殖能力，GM?CSF对骨髓内皮细胞的体外增殖有明显刺激作用。文献报道内皮细胞表面有 GM?CSFR的存在，而内皮细胞本身也可以分泌GM?CSF［11］。结合细胞周期测定的结果，可以认为，GM?CSF促内皮细胞增殖的机制可能是GM?CSF与GM?CSFR结合，通过细胞内信号传递使更多的细胞进入S期来实现的。
【参考文献】
1Luttun A, Carmeliet G, Carmeliet P. Vascular progenitors :from biology to treatment. Trends Cardiovasc Med, 2002; 12: 88-96
2Rafii S, Lyden D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med, 2003; 9:702-712
3Zammaretti P, Zaisch AH. Adult‘endothelial progenitor cells ’. Renewing vasculature. Int J Biochem Cell Biol, 2005; 37: 493-503
4Kalka C, Masuda H, Takahashi T, et al. Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Proc Natl Acad Sci USA, 2000; 97:3422-3427
5Kawamoto A, Tkebuchava T, Yamaguchi J, et al. Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia. Circulation, 2003; 107:461-468
6Hristov M, Erl W, Weber PC. Endothelial Progenitor Cells: isolation and characterization. Trends Cardiovasc Med, 2003; 13:201-206
7王绮如，严燕，汪保和.小鼠骨髓内皮细胞系的建立.中国实验血液学杂志， 1997；
5：360-366
8Yonekura H, Sakurai S, Liu X, et al. Placenta growth factor and vascular endothelial growth factor B and C expression in microvascular endothelial cells and pericyts. Implication in autocrine and paracrine regulation of angiogenesis. J Biol Chem, 1999; 274: 35172-35178
9Rieck P, Oliver L, Engelmann K, et al. The role of exogenous/endogenous basic fibroblast growth factor (FGF2) and transforming growth factors beta (TGF beta?1) on human corneal endothelial cells proliferation in vitro. Exp Cell Res, 1995; 220:36-46
10周小莹, 王绮如, 黄艳红等. 骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖的促进作用. 生理学报, 2005；
57：199-204
11仲照东, 邹萍, 刘凌波等. 利用基因芯片技术研究造血生长因子在脐静脉内皮细胞中的表达. 中国实验血液学杂志， 2004；
12：637-639?
