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【中图分类号】R969.4【文献标识码】A【文章编号】1185-1672(2009)-12-1074-04 【摘要】目的研究不同浓度瑞芬太尼对MIR大鼠心肌缺血再灌注时MIR心肌保护作用的可能机制。方法40只SD大鼠随机分为5组。对照组;模型组(缺血再灌注组);瑞芬太尼预处理各组:(瑞芬Ⅰ组浓度3μg•kg-1•min-1,瑞芬Ⅱ组浓度6μg•kg-1•min-1瑞芬Ⅲ组浓度为12μg•kg-1•min-1)。测心肌匀浆中心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、光镜观察心肌组织形态学变化;其中对照组、模型组、瑞芬Ⅱ组应用信号转导基因芯片技术检测心肌细胞凋亡相关基因表达。结果
与对照组比较,MIR时心肌细胞膜Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低,心肌组织结构明显损伤,心律失常发生率上升;瑞芬太尼组呈剂量依赖性的提高心肌细胞膜上的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性,减轻心肌组织结构损伤,减少再灌注性心律失常的发生。与对照组比较,MIR时Bax、Bcl-2、Bcl-2L1调亡相关基因表达下调,Bcl-2/Bax比率下降;瑞芬太尼组与MIR组比较,Bax、Bcl-2、表达上升而Bcl2a1、Bcl-2L1基因表达下降,同时Bcl-2/Bax比率升高。结论
瑞芬太尼预处理对在体MIR大鼠心肌有保护作用,其可能机制是恢复心肌细胞膜上的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性、通过上调凋亡调控基因BCL-2/Bax比率,抑制心肌细胞凋亡而减轻心肌细胞损伤。
【关键词】瑞芬太尼;缺血再灌注损伤;基因芯片;基因表达
Remifentanilpretreatmentonmyocardialischemia-reperfusioninjuryprotectiveeffectof
HanLei,LiuZhaofang
Anesthesiology,ShanghaiFifthPeople"sHospital,200240,China
【Abstract】ObjectivetorevealtheprotectioneffectandthepossiblemechanismofremifentanilpretreatmenttoMIRrat.Methods
40maleSDratswererandomlydividedinto5groups:controlgroup,remifentanilpretreatmentgroup1,2,3(3,6or12μg.kg-1.min-1remifentanil)andMIRgroup.IntheMIRgrouptheratsweresubjectedto30minutesischemiafollowedby45minutesreperfusion.Intheremifentanilpretreatmentgroup1,2,3,theratsweregivenwith3,6or12μg.kg-1.min-1remifentanilbybeinginfusionedintovesselviafemoralveinfor15minutesbeforeischemia-reperfusionrespectively.Afterreperfusion,leftventricularmyocardiumsamplesofischemiaareawereimmediatelyprocessed,Na+/K+-ATPase,Ca2+-Mg2+ATPaseactivitiesweremeasured,andmyocardialhistomorphologywereobservedwithmicroscope.Atthesametime,expressionofrelatedapoptosisgeneweremeasuredwithgenearraytechnology,incontrolgroup,modelgroupandremifentanilpretreatmentgroup2.Results
Withtheadministrationofremifentaniltheincidenceofventriculararrhythmiaweresignificantlylowered.Comparedwiththecontrolgroup,theactivityofNa+-K+-ATPaseandCa�2+-�Mg2+-ATPaseincellmembranedecreasedremarkably,inMIRgroup.AndremifentanilpretreatmentcouldsignificantlyrestoretheactivityofNa+-K+-ATPaseandCa2+-Mg2+-ATPaseinadose-dependentmanner.Underlightmicroscopic,thereweremyocardialtissuepatchynecrosis,myocardialfiberbreakage,myocardialcelledemaandinflammatorycellfiltrationinMIRgroup.Comparedwiththecontrolgroup,intheMIRgroup,expressionofBax、Bcl-2、Bcl-2L1andBirc1bgenesweredepressed,andBcl-2/Baxratiodescended.AndcomparedwiththeMIRgroup,inremifentanilpreconditioninggroup2expressionofBax、Bcl-2、Birc1bgeneswereelevatedbutBcl2a1、Bcl-2L1weredepressed.WealsofoundBcl-2/Baxratioascended.Conclusion
RemifentanilpretreatmentcansignificantlyrestoretheactivityofNa+-K+-ATPaseandCa2+-Mg2+-ATPaseinadose-dependentmanner.RemifentanilcanprovideprotectionfortheheartofMIRratagainstischemiareperfusioninjurybyascendingBcl-2/Baxratio.
【Keywords】Remifentanil;Ischemicalreperfusioninjury;Genechip;Genediagnosis
近年来,随着心脏外科手术和介入治疗技术的进展,心肌缺血再灌注损伤成为困扰临床医生的难题。瑞芬太尼作为一种新型超短效阿片类镇痛药在围术期日益得到广泛的运用。因此探讨瑞芬太尼在心肌缺血再灌注损伤保护作用具有重要意义。本课题以SD大鼠建立急性心肌缺血再灌注损伤在体模型,研究不同剂量瑞芬太尼对心肌缺血再灌注损伤保护作用机制。
1材料与方法
1.1材料①动物:80-100d鼠龄SD雄性大鼠40只,体重300±20g(南京市江宁区青龙山动物繁殖场,合格证号:SCXK(苏)2006-018:)。②药品和试剂:盐酸瑞芬太尼(瑞捷1mg/支,粉剂,批号601103)购自宜昌人福药业有限公司;ATP酶测试盒购自南京建成生物研究所;信号转导通路发现者基因芯片、TrueLabeling-AMP线性RNA扩增试剂盒、SuperArrayArrayGradecRNA纯化试剂盒购自美国SuperArray公司。③仪器:DW-2000动物人工呼吸机由上海嘉鹏科技有限公司制造;Spacelab监护仪和Medlab生物信号处理系统由南京美易公司制造;TGL-低温高速离心机由汉萨科学仪器有限公司制造;XHF-1高速分散器由上海金达生化仪器厂制造。
1.2方法
1.2.1在体MIR模型建立
SD大鼠禁食12h,腹腔内注射5%戊巴比妥钠40mg•kg-1麻醉,仰位固定,连接心电图Ⅱ导联于Medlab生物信号记录处理系统;切开气管,行气管插管,接WG-2000型小动物呼吸机(上海)人工呼吸(频率60beat•min-1,潮气量20ml•kg-1)。;股静脉切开置管用于输液和给药(或尾静脉、右颈内静脉置管)。沿左锁骨中线切开皮肤2cm,在4、5肋间打开胸腔,剪开心包,挤出心脏,于左冠状动脉前降支距主动脉根部2～3mm处用4～0丝线穿过动脉备用。稳定15min后,放一横置硅胶管打结结扎,心电图出现J点抬高或为单相曲线者为成功模型。结扎30min后,剪开线结再灌注45min。
1.2.2实验分组和给药
40只SD大鼠随机分为5组,每组8只。对照组:丝线穿过左冠状动脉前降支,但不结扎;缺血再灌注组(MIR组):穿线后等心电稳定15分钟,结扎血管30min后松开线结,再灌注45min;瑞芬太尼预处理各组:于MIR前静注瑞芬太尼(RPC1浓度3μg•kg-1•min-1,RPC2浓度6μg•kg-1•min-1RPC3浓度为12μg•kg-1•min-1,瑞芬太尼用生理盐水溶解)15min,其余同MIR组。
1.2.3心肌匀浆制备
再灌注结束立即取出心脏,用预冷的生理盐水冲去血渍,去除心房及右心室。取心尖部缺血区心肌组织,称重约0.2g心室肌与预冷的匀浆介质1:9混合(匀浆介质组成:Tris1.21g•L-1、EDTA-Na237.23mg•L-1、蔗糖34.2g•L-1、再以HC1滴定至pH值为7.4),在玻璃匀浆器中研磨制成l0%的混悬液,以2000r•min离心10min,取上清液放置-20oC冰箱中低温保存,检测心肌组织Na+/K+-ATP酶活性以及Ca2+-Mg2+-ATP酶。
1.2.4心肌组织基因检测
再灌注结束立即取出心脏,用预冷的生理盐水冲去血渍,去除心房及右心室。取心尖部缺血区心肌组织,称重约0.1g心室肌(在10min内),立刻放入液氮中(-70℃)或-70℃冰箱保存,冻存心肌组织放入干冰中直接运输(2天以内)。取适量(50-100mg)冻存组织样品,加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),匀浆后抽提RNA至用不含核酸酶的水溶解,然后加入350μl裂解结合缓冲液,再在样品中加入�350μl70%�乙醇,混合均匀,上结合柱,离心,用前洗涤缓冲液洗涤一次,用洗涤缓冲液洗涤2次,最后用不含核酸酶的水洗脱,获得适用于芯片分析的RNA。紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度,使用变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性。采用SuperArray公司的TrueLabeling-AMP。线性RNA扩增试剂盒合成生物素标记的cRNA探针,首先把样品RNA进行逆转录反应合成cDNA,在逆转录反应液中加入RNA扩增缓冲液,生物素标记的UTP和扩增酶类混合液,合成生物素标记的cRNA探针。使用SuperArrayArrayGradecRNA纯化试剂盒纯化cRNA探针,将纯化的cRNA探针在GEAhyb杂交液条件下与所选择的信号转导通路发现者基因芯片杂交,cRNA探针与芯片杂交后,加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶(AP)及化学发光底物反应,X射线胶片曝光在胶片上显示检测结果,X射线胶片曝光后,将胶片上的图象用扫描仪扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。使用配套软件GEArrayExpressionAnalysisSuite对原始数据进行完整的芯片数据分析。
1.2.5心肌病理组织标本制作取左室心尖部缺血心肌组织于4%多聚甲醛溶液中固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明30min,浸蜡3h,切成厚约5mm的切片,作HE染色,中性树胶封片,513T型VANOX多功能显微镜下观察拍照。
1.3统计学处理
计量资料采用�x±s�表示,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK检验,采用SPSS10.0软件包处理,使用配套软件GEArrayExpressionAnalysisSuite对原始数据进行完整的基因芯片数据分析。差异基因表达用组与组之间相对应基因表达的平均标准值的比值表示,比值>2.0或2+-Mg2+-ATP酶活性变化及瑞芬太尼对其影响
与对照组相比,MIR组心肌细胞膜Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活性明显降低(P2+-Mg2+ATPATP酶活性(瑞芬ⅠP 与缺血再灌注组相比,△P2+-Mg2+-ATP酶活性显著下降。MIR组再灌注时室性心动过速和室颤发生率高,瑞芬太尼组出现室性早博、室性心动过速和室颤发生频率和持续的时间明显低于缺血再灌注组,两组比较心律失常评分有显著的统计学意义,表明瑞芬太尼预处理能减少再灌注后心律失常的发生,再灌注性心律失常是心肌缺血再灌注损伤的重要表现形式之一,其发生机制与细胞内钙超载和氧自由基损伤有关,但确切的发生机制尚未完全明了。心律失常的发生机制与细胞膜离子转运异常有关,细胞膜上Na+-K+-ATP酶的作用是维持细胞内外Na+、K+离子的分布,进而影响细胞内水平Ca2+。三磷酸腺苷酶对维持细胞的正常生理功能极为重要。细胞膜上Na+-K+-ATP酶即钠泵在细胞静息状态时通过水解一个ATP获得能量,逆电化学梯度向细胞外转运3个Na+,同时向细胞内转运2个K+,维持细胞内高K+低Na+状态。Ca2+-Mg2+-ATP酶也是一种膜转运蛋白,对维持细胞内Ca2+稳态有重要作用,它主要分布在骨骼肌和心肌细胞内部的肌浆网上,在心肌细胞肌浆网中含量最为丰富,约占其总蛋白的90%以上,激活时可将胞浆中的Ca2+迅速集聚到肌浆网内部,使胞浆中Ca2+浓度在短时期内下降到原来的1/100。Ca2+-Mg2+-ATP酶活性受Na+-K+-ATP酶活性调节,这两种酶对细胞内离子平衡和心肌兴奋收缩耦联有重要作用[1]。可能机制与瑞芬太尼恢复心肌细胞膜ATP酶的活性、减轻细胞Ca2+超载有关。
自1995年Schena等首次报道基因表达谱以来.基因芯片技术成为研究基因表达快速而有效的方法。本实验中应用信号转导通路发现者基因芯片对大鼠心肌缺血再灌注损伤的分子机制进行了研究,它不同与以往的从单个基因、单条信号通路对缺血再灌注损伤的机制进行研究,缺血再灌注损伤是一个机体应答的整体网络调控过程,其损伤的机制不能用单一的基因和信号通路来解释,近几年来随着基因芯片技术的发展,高通量基因表达谱的出现为从整个基因组角度研究基因在转录水平的变化带来了曙光,但表达谱基因芯片的包罗万象的特征会受到这样的批评:如大海捞针式的缺乏科学假设为前提的实验方案。剔除基因芯片上对研究对象毫无意义的基因正是功能分类基因芯片与表达谱基因芯片的本质区别。功能分类基因芯片上通常只有几百个或更少的基因,这些基因包括了那些与研究对象有确定关系的基因,或至少是与研究对象的关系有待考证的基因。
在大鼠心肌缺血再灌注过程中,心肌细胞的死亡形式包括坏死和凋亡,而且在此过程中细胞的凋亡占有相当大的比例,近年研究发现细胞凋亡是心肌缺血再灌注中心肌细胞死亡的机制之一,细胞凋亡是机体在内外环境刺激下启动自身机制,由基因调控的细胞死亡过程,细胞凋亡的调控基因很多,如Bcl-2,Bax,P53,Fas基因等[2-7]。Bcl-2是一种抑制调亡基因,Bcl-2主要位于线粒体、细胞核及内质网的膜上,它能抑制线粒体通透性转变(permeabilitytransition,PT),抑制线粒体凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor,AIF)和细胞色素C的释放,而Bax是一种促凋亡基因,Bcl-2基因和Bax基因相互作用调控细胞凋亡�[8]。Bcl-2/Bax比率可反映Bcl-2/Bax在细胞凋亡中的效应,若Bcl-2/Bax比率升高,则抑制细胞凋亡;反之,则促进细胞凋亡[9]。
如Misao等[2]对37例患者包括急性心肌梗死15例、陈旧性心肌梗死12例和正常的10例进行了Bc1-2和Bax对比性观察。结果显示,正常对照和陈旧性心肌梗死者的心肌细胞未检测到Bc1-2蛋白,而急性心肌梗死9例(60%)Bc1-2过度表达,而Bax在陈旧性心肌梗死10例(83%)过度表达,急性心肌梗死中仅有2例;表明Bc1-2/Bax表达比值可能对心肌IRI中心肌细胞凋亡的保护或促进起着重要的病理生理作用。
在本实验中MIR组与对照组相比虽然Bcl-2和Bax基因在心肌缺血再灌注都是下调的,但Bcl-2/Bax比值是降低,最终介导细胞的凋亡。与MIR组比较,瑞芬太尼组Bcl-2和Bax上调,Bcl-2/Bax比值却是上升的,抑制心肌细胞凋亡。瑞芬太尼预处理可能通过影响细胞凋亡相关基因的表达而发挥抗凋亡作用。
4结论
瑞芬太尼对MIR大鼠心肌有明显的保护作用,其作用机制可能是通过恢复心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶活性有关。
瑞芬太尼能通过对MIR大鼠心肌细胞凋亡相关基因的调控,达到减轻或防止心肌缺血再灌注损伤的作用。
参考文献
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(收稿日期2009-12-07)(编辑吴友农)
