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【摘要】 许旺细胞在周围神经损伤修复过程中起着重要作用，为保证高质量、高数量、高纯化度的许旺细胞，本篇将对许旺细胞的精确检测和鉴定的新进展作以综述。许旺细胞的检测、鉴定技术正日臻完善，不断提高，但仍缺乏系统性。许旺细胞的活性检测可分为MTT法，显微分光光度和显微图像分析技术，H3-胸腺嘧啶核苷测定，以及DNA受损程度的测定(单细胞凝胶电泳)。此外，许旺细胞的鉴定分为形态学观察和免疫学鉴定两种。上述各种技术的主要目的是让许旺细胞更有效的在人工组织修复损伤的周围神经再生方面发挥作用，并在功能和特点上进一步完善。
【关键词】许旺细胞；检测；鉴定；综述文献
组织工程化神经桥接体的构建过程中，高质量、高数量体外培养的许旺细胞是至关重要的，近年来许旺细胞的实验研究与日俱增，但在体外培养和纯化过程中无法避免成纤维细胞的生长。在有大量成纤维细胞的环境中，如何精确检测许旺细胞的各项功能指标以保证许旺细胞良好的生长活性并准确鉴定哪些培养细胞为许旺细胞。这将为许旺细胞的进一步分离和高质量、高数量、高纯化度的提取及应用奠定理论基础，以更好的应用于周围神经损伤后神经桥接体的构建。本篇文章应用计算机检索PUBMED和CNKI2000-2007相关文章，对许旺细胞的检测与鉴定做系统的综述。
1 基质干细胞诱导为许旺细胞过程中的特征变化
2003年，王剑等[8]在用成人骨髓基质干细胞诱导分化许旺细胞的实验过程中观察，hMSCs经BHA作用3 h后，细胞体积明显变小，部分细胞呈高折光率，立体感增强；部分呈橄榄状，两极有细长突起；部分细胞呈小圆形，有数个细丝状胞突呈放射状分布；部分细胞呈狭长柱状，两极生出多个平行的细丝状胞突；部分细胞漂浮、死亡。hMSCs继续经RA作用3 d后，细胞体积进一步缩小，呈橄榄状细胞增多，部分细胞两极有“芽突状”突起形成，并相互连接形成类似“突触状”结构。此时细胞与背景颜色接近，边界不十分清晰，但立体感明显，胞体狭长。然后hMSCs继续经Forskolin、Bfgf、PDGF和HRG诱导，部分细胞体积明显变小，外观狭长，立体感增强，部分胞体周围有“亮晕”形成， 胞体两极出现细长胞突，随细胞数目增多而呈平行排列，且胞突间首尾相接。
2 许旺细胞各项活性检测
组织工程支架材料上许旺细胞的成活状态及生物活性是移植体成功与否的关键。随着近年组织工程技术的发展，如何方便、准确地评价支架上许旺细胞的活性，如细胞的形态、分裂和增殖、DNA受损程度、细胞对基底材料的附着等成为急需解决的问题。本篇将对MTT法，显微分光光度和显微图像分析技术，H3-胸腺嘧啶核苷测定，以及DNA受损程度的测定(单细胞凝胶电泳)进行对比，从多个角度检测支架材料上许旺细胞的活性。
2．1 许旺细胞增殖能力的测定
2．1．1 MTT测试 2002年，胡唏棠等[6]用MTT法从成年大白鼠坐骨神经分离培养许旺细胞并检测活性。MTT的化学名称为溴化-3-(4，50二甲基-乙-嗪唑基)2，5-二苯基四氮唑，它是一种显示活细胞线粒体脱氢酶的四唑盐，即能被活细胞线粒体脱氢酶还原形成蓝色的结晶体-甲攒(Formazan)。如果细胞数量较多，细胞生长良好，线粒体功能旺盛，则线粒体上的脱氢酶含量就高，与MTT作用后所形成的甲攒量也多，反之，所形成的甲攒量少。
2．1．2 H3-胸腺嘧啶核苷测定
胡唏棠等利用同位素H3标记胸腺嘧啶核苷测定，可作为DNA合成物的检测，从而量度许旺细胞增殖的活力。测试日期与MTT测试同步进行，按Cheungt J的方法。每项实验重复3次。实验所得结果经SPsS和EXCEL软件运用t检验等进行统计学处理及制图。
2．1．3 显微分光光度技术和显微图像联合分析技术(Micro-spectrophotometer and micro-imaging analysis)
2002年，李文萍等[10]利用显微分光光度技术和显微图像联合分析法对许旺细胞在人工神经支架材料上三维培养的体外活性进行了研究。显微分光光度和显微图像分析技术，可以在细胞水平上对细胞成分进行定性、定量、或局部定位分析，它把定性细胞化学方法推进到数值化局部定量的研究范围，利用该技术可对细胞实现快速、灵敏度高和抗干扰能力强的显微样品分析。以往二维的图像分析法由于受许旺细胞突触的厚度及突触的空间折叠影响，当许旺细胞的生长密度较大时，无法准确描述其生长状况。由于三维培养的许旺细胞处于不同的成像焦面，所以其生长活性的在位检测难以实现，把它消化下来，贴壁生长后行抗S-100蛋白单克隆抗体免疫组化染色，检测许旺细胞的S-100蛋白表达量、单位面积内细胞分化数、突触生长面积网化度，结果显示许旺细胞的生长、增殖情况。
2．2 许旺细胞DNA受损程度的测定(彗星检测)
李文萍等[10]应用单细胞凝胶电泳技术测定了许旺细胞DNA受损的程度。单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis,SCGE)是一种利用碱性条件溶解细胞进行电泳的DNA断链检测技术，具有敏感、快速、简便、重复性好、低耗等特点，是近年来流行的DNA损害检测方法。细胞DNA受损后会引起DNA的高级结构变化，其超螺旋结构松散。这种细胞经原位裂解、DNA解链等过程后，电泳时，损伤的DNA从核中移出，朝阳极方向迁移，呈现尾形分布，而未损伤的DNA部分保持球形，荧光染色后观察所构成彗星状图样。DNA迁移距离(表现为彗星长度)和DNA含量(荧光强度)分布与DNA损伤程度相关。
3 许旺细胞的鉴定
3．1 显微镜形态观察
Murray首先描述了许旺细胞形态学及免疫组化鉴定许旺细胞形态学特征，典型特征为梭形，胞体小，胞核明显。S-100免疫组化观察，细胞染色为棕黄色，核膜明显。
3．1．1 倒置显微镜观察
2003年，丁文龙和汪洋[7]在体外培养的大鼠许旺细胞神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达实验中，在倒置相差显微镜下观察活的许旺细胞绝大多数能牢固贴壁，细胞为梭形，少量的为椭圆形或三角形，胞体饱满，立体感强，折光性好。经甲苯胺蓝染色的许旺细胞轮廓清晰，胞核呈紫蓝色，着色深而均匀。许旺细胞平行排列或互相桥联，呈“手拉手”，“肩并肩”。
3．1．2 扫描电镜观察
许旺细胞为橄榄形，突起呈圆索状伸展。胞体表面有颗粒状隆起，亦可见绒毛样突起。细胞聚合在一起呈条索状，类似于体内排列形成的Bunger带。
3．1．3 激光扫描共聚焦显微镜检测方法
主要观察许旺细胞在三维材料上的生长情况，用SABC-CY3染色，染色的许旺细胞呈鲜红色、梭形，胞核不明显。
3．1．4 透射电镜观察
许旺细胞中央最厚部厚度0．002 mm，向两端逐渐变薄，细胞紧密贴附生长，有时复层生长，许旺细胞细胞核扁长。核糖体丰富，内质网分散，线粒体小，分布于核周，高而基体明显，位于核周区。
3．2 免疫学鉴定 Eglitis和Mezey发现MSC在某种特定条件下表达胶质细胞标记物。S-100与GFAP被公认为许旺细胞的标记物，在周围神经损伤的修复实验研究中，hMSCs经诱导后S-100与GFAP的免疫组化染色结果应都为阳性，从而说明转化后的细胞不仅从形态学特征上呈现许旺细胞的外观，而且从功能学角度表达特定的蛋白产物。许旺细胞的表面标志蛋白有神经胶质纤维酸性蛋白、S-100、NGF、BDNF、p75受体等。
3．2．1 神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定 2003年，王剑等[8]在成人骨髓基质干细胞体外诱导为许旺细胞的实验研究中通过对神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的检测对许旺细胞进行鉴定。GFAP是构成神经胶质细胞的主要细胞骨架蛋白，是许旺细胞表面的标志蛋白，其表达的高低可以反映胶质细胞的功能状态。
3．2．2 许旺细胞S-100、NGF、BDNF免疫组化鉴定 2003年，丁文龙和汪洋[7]在体外培养的大鼠许旺细胞神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达实验中对许旺细胞采取S-100、NGF、BDNF免疫组化鉴定。S-100是存在于神经系统细胞胞浆内的一种酸性钙结合蛋白，因其可溶于100%的硫酸溶液而得名，检测这种蛋白质的存在，可作许旺细胞鉴定之用。S-100免疫细胞反应阳性，NGF、BDNF免疫细胞化学反应阳性的许旺细胞呈棕褐色。阳性反应的许旺细胞以梭形为主、少量的为椭圆形或三角形，细胞边界清晰。
4 展望
尽管本篇论述的很多实验技术都取得了较大进展，但是还有较多相关问题需要给予解决，例如:实验中转化后的许旺细胞在生存能力与增殖能力方面是否发生改变？实验过程中是否导致表面标志蛋白的变化或活性的变化？以上综述的MTT法，H3-胸腺嘧啶核苷测定，DNA受损程度的测定(单细胞凝胶电泳)，显微分光光度和显微图像分析许旺细胞的S-100蛋白表达量、单位面积内细胞分化数、突触生长面积网化度的方法及许旺细胞的鉴定方法等等，对人工神经支架上许旺细胞生长活性做了综合性的初步体外评价，以便指导下一步人工神经的制备及动物体内研究，并为人工神经生物材料的选择提供可能的技术手段。
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