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【摘要】目的:研究不同炮制方法的山楂(Crataegus pinnatifida Bunge)提取物的抗氧化活性。方法:采用FRAP法(Ferric reducing antioxidant potential Assay)分别测定不同炮制方法的山楂提取物的抗氧化活性。结果:生山楂提取物的FRAP值为0.3713mmol/LTrolox; 炒山楂提取物的FRAP值为0.3153mmol/LTrolox; 焦山楂提取物的FRAP值为0.1289mmol/LTrolox; 山楂炭提取物的FRAP值0.1952mmol/LTrolox; 不同炮制方法的山楂提取物的抗氧化活性大小为生山楂>炒山楂>山楂炭>焦山楂。结论: 不同炮制方法的山楂的抗氧化活性存在一定的差异,应与其黄酮类成分的含量相关。
【关键词】山楂;炮制; FRAP;抗氧化活性;黄酮
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)09-0150-02
山楂为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br 或山楂C. pinnatifida Bge. 的成熟果实。除此之外,大果山楂C. pinnatifida Bge. 、野山楂C. cuneata Sheb.et Zucc 等的成熟果实也作习用品使用[1]。临床上常用炮制品,规格有生山楂、炒山楂、焦山楂和山楂炭等[2]。山楂化学成分主要为黄酮类和有机酸[3]。山楂味酸、甘,微温;入脾胃、肝经,具有消食健胃,行气散瘀之功效[4]。不同炮制品的功效和应用亦不同,在临床上生山楂多与不同的药物配伍治疗高脂血症、高血压病、冠心病等心血管疾病; 炒山楂用于脾胃虚弱,运化失常,纳谷不香,大便不实; 焦山楂用于治疗细菌肠炎及小儿腹泻; 山楂炭有活血行瘀的作用[5]。现代研究表明,山楂炮制后,其化学成分如有机酸、黄酮、磷脂和微量元素等的含量均发生了变化,山楂中抗氧化的主要成分总黄酮类成分含量在炮制过程中,随受热时间的延长,温度的升高,而呈下降趋势[6]。毛淑杰等在实验研究中发现焦山楂与山楂炭中总黄酮类成分分别保留41. 9%与25. 8%[7] ;陈奇云等的结果表明,炒山楂中总黄酮成分保留约80%,山楂炭保留约50%[8]。从而改变了山楂的药理作用和临床疗效。而本实验将不同炮制方法的山楂用50%乙醇提取[9-12],然后采用FRAP法检测不同炮制方法的山楂提取物的抗氧化活性。
诸多疾病的发生和发展与自由基导致的机体细胞氧化损伤密切相关[13-14],所以从天然产物中寻找安全和有效的抗氧化剂成为研究的热点之一。目前已报道了多种检测抗氧化剂的方法,本实验采用的微型FRAP 法(Ferric reducing antioxidant potentialassay)是基于氧化还原反应的比色法[15]。在低pH值溶液中, 抗氧化剂还原Fe3+ -TPTZ复合物, 形成蓝色Fe2+-TPTZ溶液, 在593nm处有最大吸光度, 增加的吸光度与总的抗氧化剂能力成正比, 其中以水溶性维生素E类似物Trolox作为标准对照物, 结果用Trolox(μmol/L) 的相对值表示。Trolox虽属于水溶性物质, 但室温具有难溶性, 加热之后可溶解[16]。
1 材料与仪器
1.1 仪器:电子天平,BS124S,赛多利斯;超声波清洗机,SB5200,宁波新芝生物科技公司;粉碎机,JW-DFY-250,上海标本仪器厂;四孔水浴锅,HHS21-4,上海博迅实业有限公司;多功能酶标仪,SpectraMax M2,Molecular Devices 公司。
1.2 试剂:水溶性维生素E ( TroloxTM,6-hydroxy-2,5,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)、2,4,6-三吡啶基三嗪TPTZ(2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine)购于Sigma 公司。 其他试剂均为国产分析纯。
1.3 药材:山楂采购于上海徐重道药材饮片公司,经上海中医药大学教学实验中心李俊松鉴定为山楂。炒山楂、焦山楂和山楂炭均按现行药典要求炮制,经鉴定为合格品。山楂净选去核,固体样品粉碎机粉碎,过60目筛,装瓶备用。
2 方法
2.1 山楂提取物溶液的制备:称取5.0g 山楂粉于200ml锥形瓶中,加入80ml体积分数50%的乙醇溶液,在温度50℃的条件下超声提取20min,过滤后残渣分别用80ml和40ml再次提取,合并3次滤液,恒温水浴蒸发至干,得浸膏,此即为山楂提取物。将山楂提取物用50%的乙醇配成浓度为5g/l的溶液冷藏,备用。同样方法制备炒山楂、焦山楂和山楂炭提取物溶液冷藏,备用。
2.2 抗氧化活性的测定:取2. 1项下各供试品溶液5μL,加入FRAP工作液(300mmol/l醋酸盐缓冲液(pH 3.6), 10mmol/lTPTZ, 20mmol/l FeCl�3)245μl, 混匀反应10min,于593nm处读取吸收度, 并作空白对照,即5μl PBS溶液加入245μl FRAP工作液。以Trolox为标准物质绘制标准曲线,样品的抗氧化能力以FRAP值表示: 1FRAP单位=1mmol/l Trolox,即样品的抗氧化能力相当于Trolox的mmol/l数。
3 结果
评价一种物质的抗氧化活性能力,即对自由基的清除能力,多采用抑制率进行衡量。国际上一般用Trolox(一种合成抗氧化剂)等同抗氧化活性值来评价天然抗氧化剂的抗氧化能力,即1mmol/l 天然抗氧化剂的抗氧化能力相当于Trolox 同等浓度的浓度数。本实验采用FRAP 法测定了山楂不同炮制品的抗氧化活性,并以mmol/L Trolox为等同抗氧化活性值表示。
4 结论
本实验中不同炮制方法的山楂提取物的抗氧化活性大小依次为生山楂>炒山楂>山楂炭>焦山楂。证明了生山楂较其他炮制品的强抗氧化活性。证明了临床上选用生山楂治疗高脂血症、高血压病、冠心病等心血管疾病的依据。
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作者单位:201203 上海中医药大学教学实验中心�1
201203 上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心�2
