【www.zhangdahai.com--可行性研究报告】
材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器。METTLER TOLEDO电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，HH-Z数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司），TGL-16G 台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂），DYY-2C型电游仪（北京市六一仪器厂），核酸蛋白分析仪（DU64O 型），BIO-RAD ChemiDoc XRS+化学发光成像仪（美国BIO-RAD），BIO-RAD CFX ConnectTM 荧光定量 PCR 检测仪（美国BIO-RAD）。
1.1.2试剂。β-巯基乙醇、酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）、液氮、 Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、EDTA-Na2（乙二胺四乙二钠盐）、CTAB（溴化十六烷基三甲胺）、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、GoldView 核酸染料、6×loading buffer、核糖核酸酶。
1.1.3试材。苦参由野外采收，经贵州医科大学药用植物学与生药学教研室常楚瑞老师鉴定为苦参（Sophora flavercens Ait.），将采收回来的苦参种植以备后续试验所需，以苦参新鲜幼嫩叶片为 DNA 提取的材料。
1.2方法
1.2.1经DNA的提取与检测。根据文献[6]的CTAB法略做改进，提取苦参DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的片段大小、降解情况及浓度。取 8 μL DNA原液， 加 2 μL 6×loading Buffer，混匀后点入琼脂糖凝胶，100 V 恒压电泳40 min，凝胶成像仪上观察并拍照。
1.2.2核酸蛋白分析仪检测。取1 μL DNA 原液，用微量分光光度计测定提取 DNA 的A260/280值。A260/280应在1.80～2.00，低于1.80说明蛋白质、多糖和苯酚未除尽，高于 2.00 说明可能还含有 RNA。
1.2.3单因素试验。PCR 反应体系总体积为25 μL，内含Mg2+ 浓度 2 mmol/L、dNTPs 浓度 0.4 mmol/L、引物0.5 μmol/L、模板 DNA 30 ng、Taq DNA 聚合酶 1 U。PCR 扩增程序为95 ℃ 预变性 5 min、95 ℃ 变性 30 s、58 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸 60 s，35 个循环，72 ℃ 延伸 5 min[7]。扩增产物用 2.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，GoldView 核酸染料染色，在1×TAE 缓冲液中100 V恒压电泳 40 min，凝胶成像仪上观察并拍照。以预设反应体系为基础，对模板DNA、引物、Mg2+、Taq DNA 聚合酶和 dNTPs 这 5 个主要影响反应体系因素进行条件摸索，预设的各因素浓度水平如表1所示。
1.2.4ISSRPCR反应体系的正交优化。通过预试验，以模板 DNA、引物、Mg2+、Taq DNA 聚合酶和 dNTPs 这 5 个主要影响反应体系因素[8-11]，最适引物 UBC 881（GGGTGGGGTGGGGTG）进行正交试验，每个因素选择 4 个水平，设计因素水平（表2）。
1.3数据分析依据扩增条带的多少、清晰度、亮度和杂带的有无对PCR扩增结果进行打分，最低分0分，最高分为16分。求出同因素不同水平间的极差值R，对各因素不同水平均值Ki值制作Excel表进行数据分析，确定各因素的最优用量和浓度水平。
2结果与分析
2.1DNA 检测由图1可见，经典 CTAB 法提取的 DNA 条带清晰，分子量大小一致，电泳条带较亮，说明该方法提取 DNA 浓度较高，其 A260/280为1.8～2.0，DNA 浓度为795～2 800 μg/mL，说明 CTAB 法提取的 DNA 质量较高，可用于后续试验。
2.2单因素试验模板DNA、Mg2+、Taq DNA聚合酶和dNTPs在浓度范围内扩增的条带较多且清晰明亮。引物浓度在 0.1和 0.3 μmol /L时较其他浓度条带多，扩增效果好。依据单因素试验结果，选择扩增效果好的浓度范围，重新划分 4个浓度梯度（表2），作为正交试验各因素的水平。
2.3ISSR引物扩增检测从图2可看出，由于模板 DNA、引物、Mg2+、Taq DNA 聚合酶和 dNTPs 5 种影响因素组合的不同，扩增效果存在明显差异。4 和 14 号没有扩增条带，8 和 10 号有微弱的扩增，1、2、3、7、9、11和13号有明显的扩增，1、2、3、9、11和13号泳道有弥撒现象，9、11和13号扩增多态性较1、2、3和7号好，5、6、15、16号有明显的扩增，条带清晰可辨，但亮度较暗，因此综合扩增条带的数目、强弱清晰度和可分辨率等指标比较，12 号因素水平组合（模板 DNA 90 ng、0.4 μmol/L 引物、2.0 mmol/L Mg2+、Taq DNA 聚合酶 0.5 U、0.5 mmol/L dNTPs）扩增的效果最好，条带相对较多且清晰。由表3可知，苦参 ISSRPCR 体系中含因素影响从大到小依次为引物、dNTPs、Mg2+、模板DNA、Taq DNA 聚合酶，可见，引物影响最大，而 Taq DNA 聚合酶影响最小。最佳的 ISSRPCR 反应体系为A3B3C2D1E2，即模板 DNA 90 ng、0.3 μmol/L 引物、2.0 mmol/L Mg2+、Taq DNA 聚合酶 0.5 U、0.4 mmol/L dNTPs，与电泳图的直观分析相比，只有引物和 dNTPs 浓度不一样，所以正交试样 12 号为最佳的ISSRPCR 反应条件。根据确定的 ISSRPCR 反应体系对 19 份苦参样品检验， 结果条带多且清晰明亮，证明该体系稳定可靠，可用于苦参遗传多样性分析。
3讨论与结论
苦参的化学成分主要有生物碱和黄酮类化合物，同时含有糖、酚和蛋白质等一些次生代谢物质，该试验以苦参新鲜幼嫩叶片为试验材料，用经典CTAB法对苦参进行 DNA提取，结果提取的DNA质量较好，可以满足后续试验。
引物浓度会对PCR所扩增的带型产生明显的影响，浓度过低时PCR产率会大大降低，甚至不能扩增，浓度过高时PCR所扩增的条带会变得模糊，还会产生新的位点，非特异性扩增增加；Mg2+ 作为ISSRPCR反应中的一个主要因素，其浓度的变化对整个PCR反应中的Taq DNA聚合酶的活性、引物的退火温度以及 PCR扩增条带的特异性均有一定的影响；DNA模板量也是影响ISSRPCR扩增效果的主要因素之一，模板量过低，无扩增产物或产物少而不稳定，量过高，又会导致扩增条带的模糊和非特异性产物的出现；酶的用量在PCR反应中也是一个重要的影响因素，浓度过低则不能扩增，浓度太高又会产生非特异性扩增且增加成本；dNTPs是PCR扩增反应中磷酸基团的主要原料，dNTPs的浓度对PCR反应有至关重要的影响，当 dNTPs浓度较高（>200 μmol/L）时，可加快 PCR的反应速度，但同时也会增加碱基的错误掺入率与试验成本，当dNTPs 浓度较低（<50 μmol/L）时，则会导致PCR 的产率下降，因此，dNTPs的浓度常控制在50～200 μmol/L为最佳[11]。该研究通过 ISSRPCR反应体系的建立与优化，确定最适黔产苦参ISSRPCR的反应体系为模板DNA 90 ng、0.4 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、Taq DNA聚合酶 0.5 U、0.5 mmol/L NTPs。苦参 ISSRPCR 反应体系的建立填补了国内苦参 ISSR 分子标记的空白，为利用分子标记技术研究苦参种质资源鉴定和遗传多样性等提供理论依据。
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