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摘要：用３种不同的培养基培养黄牛卵母细胞，结果表明，ＴＣＭ－１９９基础型和商用Hｏｌｄｉｎｇ型培养基可使其成熟率达到８０％，ＤＭＥＭ基础型尽管可使颗粒细胞生长良好，但卵母细胞的成熟率极低。
关键词：黄牛卵母细胞；培养基；成熟；比较
中图分类号：Ｑ８１３；Ｓ８１４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７－２７３Ｘ（２０12）05-0006-02
卵母细胞体外成熟是牛体外受精、体细胞克隆等相关胚胎工程技术研究和体外胚胎生产的第一步［１］。然而，体内成熟的卵母细胞难以满足实际工作的需求，屠宰场的卵巢上大量的未成熟卵母细胞通过体外培养成熟，将可以提供足够的成熟卵母细胞。本试验比较３种不同培养基的培养效果，以为同行研究提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 未成熟卵母细胞的来源
屠宰场的卵巢保存在３５℃保温桶内，在２ｈ内运回实验室。灭菌生理盐水冲洗２～４次， 用１６号针头抽取卵巢表面３～８ｍｍ的卵泡。在３５ ℃的热台显微镜下，从卵泡液中捡取形态正常、胞质均一且至少有３层颗粒细胞的未成熟卵母细胞―卵丘卵母细胞复合体（Ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ， ＣＯＣｓ）转入培养基中，在３９℃、５％ ＣＯ２、饱和湿度条件下培养２４ｈ［２，３］，培养基分别为：Ａ．ＴＣＭ－１９９＋１０％ＦＢＳ＋１０ ＩＵ／ｍＬ ＰＭＳＧ＋１００ ＩＵ／ｍＬ双抗，ｐＨ ７．３；Ｂ． Ｈｏｌｄｉｎｇ培养液（购自北京谭河科技公司）；Ｃ ．ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ ＋１０ ＩＵ／ｍＬ ＰＭＳＧ。
１．２ 卵母细胞的成熟鉴定
２４ｈ后，卵母细胞转入含有０．１％透明质酸酶溶液中，孵育５ｍｉｎ，用吸卵管反复吹打卵母细胞，除去其周围的颗粒细胞，在倒置显微镜下观察，以第一极体排出作为卵母细胞成熟的标志，若极体位于视野对侧则不易观察，可用异物针轻轻拨动卵母细胞，以便更好地观察其极体排出情况。另外，对于无法判别卵母细胞的进行孤雌激活，条件为：置于２ｍｍｏ／Ｌ的６－ＤＭＡＰ中激活４ｈ，洗３次，７％乙醇激活５ｍｉｎ［４］。每组试验重复３次。
１．３ 数据统计
数据采用卡方分析。
２ 结果与分析
判定卵母细胞成熟率可用两种方法，一是以看到极体定为成熟，但角度不合适时看不到极体，这样成熟率易被低估；二是以激活后的卵裂率计成熟率，这种情况基本能反映卵母细胞的成熟率，但当培养基或激活条件不理想时，也会出现成熟率被低估的现象。
从表１中可以看出，３种培养基对卵母细胞极体成熟率（看见极体率）及卵裂成熟率（激活后卵裂率）的影响差别明显，其中，Ｃ组最低，与Ａ、Ｂ组间差异均达极显著水平，Ａ、Ｂ组之间有差异，但不明显。所以黄牛卵母细胞培养用Ａ、Ｂ培养基可以达到体外成熟的目的。
３ 讨论
牛卵母细胞培养的关键是培养基的选择，其中，商业化的培养基如Ｂ培养基及ＴＣＭ－１９９型基础培养基其卵母细胞体外培养成熟率（见极体率）可以达到８０％［５，６］，而本试验接近这一值；卵裂成熟率达到８０％以上，与毛晶等［7］的试验结果不一致，这有可能是在观察极体技巧方面存在偏差。试验用ＤＭＥＭ基础型培养基是考虑让颗粒细胞充分发育，为卵母细胞提供滋养层的营养支持，此次试验结果显示其颗粒细胞尽管长势良好［８］，但卵母细胞成熟率低，可见单纯的颗粒细胞发育没有明显促进卵母细胞发育成熟的作用［９］。
参考文献：
［１］ 李喜春，王 恒．牛卵母细胞体外成熟培养研究进展［Ｊ］．中国牛业科学，２００６，３２（４）：４１－４５．
［２］ 彭 辉，李 莉，卿素珠，等．ＩＴＳ、卵巢保存温度及所处性周期对黄牛卵母细胞和孤雌胚体外发育的影响［Ｊ］．湖北农业科学，２００９，４８（１）：１２８－１３２．
［３］ 刘 赫，沙 伟，殷志明，等．牛卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎培养的研究［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２００８（１０）：２３－２５．
［４］ 李雪峰，安志兴，郭继彤，等．几种不同化学激活方法对牛卵母细胞孤雌激活的影响［Ｊ］．西北农林科技大学学报（自然科学版），２００２，３０（２）：４３－４８．
［５］ 章美玲，章孝荣．牛卵母细胞体外成熟的影响因素［Ｊ］．畜牧与饲料科学，２０１０，３１（５）：１５－１７．
［６］ 隋进强，云 彦，刘文强，等．牛生发泡期裸卵体外成熟培养体系的建立［Ｊ］．农业生物技术学报，２０１０，１８（１）：１９８－２０４．
［７］ 毛 晶，李钟淑，蔡文莲，等．聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白对牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的影响［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２００８（１０）：１２－１５．
［８］ 邓 雯，禹学礼，庞有志，等．处理方式不同的颗粒细胞和卵泡液对牛卵母细胞体外受精后卵裂率和囊胚率的影响［Ｊ］．分子细胞生物学报，２００８，４１（５）：３９３－４０３．
［９］ 曹 亮，聂 旭．牛卵母细胞体外成熟的培养体系及影响因素的研究［Ｊ］．畜牧兽医科技信息，２００９（４）：６３－６４．
