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【摘要】:本文通过分析免疫组化技术的原理及科研价值,把它在小鼠组织中的具体应用,存在的具体问题和注意事项逐步剖析开来。旨在根据小鼠组织的特有情况进一步优化免疫组化的条件,针对性的解决小鼠在应用该技术时存在的局限性,使我们能得到更好的小鼠组织切片和实验数据。
【关键词】:小鼠组织;免疫组化技术
【中图分类号】R392.33【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)06-034-1
医学研究和科研领域经常会应用动物模型来进行研究,以此来探索人类疾病的模拟反应。在过去一个世纪的研究中,小鼠已经成为建立人类疾病的动物模型的最佳实验材料。当科研人员应用小鼠做为研究对象时,往往采用免疫组织化学的方法对小鼠组织进行鉴定和分析。但是由于免疫组化操作的影响因素诸多,免疫组化效果不稳定等因素常常困扰着免疫组化操作者。本文就以上相关问题进行了简单的总结和分析。
1小鼠组织的应用
小鼠经常被用作动物模型进行科学研究,因为现在小鼠的基因改造技术越来越成熟,并且它的生理生化及发育过程类似于人类,基因组也和人类有90%同源,所以小鼠模型可以基本上真实模拟人类的功能活动和反应;小鼠作为遗传学研究材料的另一优势还在于其基因组计划已基本完成[1]。基因组序列的大量信息为研究基因功能及其表达调控、胚胎发育和人类疾病的分子机制提供了条件基础和技术手段。
2免疫组化的原理及优点
免疫组化技术是在组织化学的方法上结合免疫学的理论和技术发展起来的一门新技术,能将形态、代谢和功能密切结合起来。简单地说,用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体,其结合后经一系列方法的处理,出现呈色反应,这样在光镜下就可以确定组织的来源属性和部位。免疫组化技术还有着以下的优点。(1)特异性强,抗原抗体的结合具有高度特异性;(2)敏感性高。由于ABC发或SP法的出现时抗原抗体的结合更敏感;(3)定位准确,免疫组化技术可在组织和细胞内准确定位。
3实验中存在的问题及注意事项
3.1组织的预处理
因为小鼠模型都十分珍贵,所以我们在试验中应尽量减少失败的几率。首先,小鼠组织的剥离要迅速,固定要及时,否则很多组织比如脑组织很容易被破坏。其次,固定时间要适当。固定时间以常温下6-12小时为宜。过度固定可能导致组织抗原的损失,影响实验效果[2,3]。最后,组织的脱水时间要适当。拿裸鼠为例,因为其组织比较柔嫩,所以脱水时应该从低浓度乙醇开始,比如50%乙醇梯度开始,并且适当缩短脱水,透明的时间,防止小鼠组织变形,变脆变硬,影响后面的切片和形态观察。
3.2免疫组化实验步骤
免疫组织化学技术是多步骤、多因素决定的实验方法,任何一个环节稍有不慎,都直接影响免疫组化的结果。下面从以下几个方面进行阐述:(1)抗原修复。由于小鼠组织在福尔马林或其他固定液中会引起蛋白内或蛋白间亚甲基桥的桥连,导致许多抗原簇被封闭。所以,需要先进行抗原修复或暴露。试验中应该根据具体组织和抗体选择最佳的修复方法。(2)减少或消除非特异染色。一般小鼠组织中免疫组化的非特异染色较深,常常干扰实验结果的观察。我们应该从以下方面尽量避免:①抗体浓度要适合。试验中通过设计梯度稀释抗体来确定最佳抗体稀释浓度。抗体浓度过高也会产生非特异染色。②PBS洗涤要充分。试验中尽量使用新鲜的PBS,每次的洗涤时间也要严格按照说明书进行。③实验用的封阻血清要确保与一抗同源,封阻时间也要足够。④实验的整个过程中都要确保组织不能干掉。(3)DAB显色:对二甲胺基偶氮苯(DAB)显色的时间也不同程度影响免疫组化的最终效果。最好显微镜下控制显色,所以操作者应具备一定的常用抗体定位的知识,不要显色时间太长,如果无阳性物质,显色时间过长无益,只能使假阳性的机率倍增。
3.3结果的判断和分析
免疫组化染色结果的判断应该是阳性染色强而非特异染色很淡或无,两者形成鲜明的对比,阳性标记物的位置准确(核、质、膜、血管壁或间质等),细胞边界清楚。判断根据:根据阳性细胞的染色强度:(无着色细胞)(一),(+),(+ +),(卅)。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。另外实验的进行还必须设有对照,比如阳性对照,阴性对照,自身对照等,这对结果的分析很重要。
4总结
总之免疫组化是一项很精确的实验技术。它在小鼠组织研究上的应用有着很重要的科研价值和潜力。近年来,由于检测技术敏感性的不断增强;单克隆抗体的制备;基因库的建立;以及修复抗原性的各种措施、特别是热预处理法的出现与发展,使得免疫组化技术的使用迈出了崭新的一步。虽然该技术也同时存在很多困难,但是只要我们认真操作每一个步骤,一定能做出高质量的小鼠的免疫组化切片并且得到有用的实验结果。
参考文献
[1] 范尔钟,李颖,刘仲燕.免疫组化技术在实验动物组织中的应用体会[J].临床与实验病理学杂志,2005,21(1).
[2] 冯静洁,吴玉玉,齐晓薇,张绪森.免疫组化技术应用中的影响因素分析[J].淮海医药,2006,24,(4).
[3] 王丽,张秋金,林齐心,等.初论免疫组化标准化(一)[J].诊断病理学杂志,2003,10(5):310-311.
