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摘要：荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)是目前应用较为广泛的核酸定量方法，病毒核酸定量能直观地反映病毒在体内的复制程度，因此，FQ-PCR在对病毒性肝炎的早期诊断、治疗、疗效观察及判断预后等方面有着显著的应用价值。
关键词：病毒性肝炎；荧光定量聚合酶链反应；诊断
中图分类号： R512．6；R446 文献标识码： A 文章编号： 1008-2409(2007)06-1412-02
聚合酶链反应（PCR）技术是一种以核酸生物化学为基础的分子生物学诊断技术，自1985年问世以来，已成为生物医学领域最有价值的研究手段之一[1]。PCR技术经历了由定性走向定量的发展过程，荧光定量PCR（FQ-PCR）就是近年来发展起来的备受关注的定量PCR技术，主要用于核酸定量检测，可反映病毒在体内的复制情况。该技术在临床上感染性疾病应用中相当广泛，尤其是在病毒性感染疾病的诊疗方面的应用更为普遍。病毒性肝炎的病原体主要有甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、戊型肝炎病毒（HEV）、庚型肝炎病毒（HGV）及输血传播病毒（TTV）等。甲型肝炎、丁型肝炎及戊型肝炎有较好的血清学诊断指标，一般不需要进行基因诊断，庚型肝炎病毒（HGV）及输血传播病毒（TTV）分别自1996年、1998年以来国内才有所报道[2]，其基因诊断在临床上应用较少。FQ-PCR主要用于对乙型肝炎和丙型肝炎的早期诊断、治疗、疗效监测以及预后判断、分子流行病学调查等方面，以下就其各临床应用作一综述。
1 分析技术
PCR技术其实是脱氧核糖核酸（DNA）热变性、复性原理的应用，循环重复着 “变性―退火―延伸”三个基本反应步骤。FQ-PCR是指在普通PCR扩增体系中，加入一个靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，5′端标记荧光发射集团，3′端标记荧光淬灭集团，当探针完整时，后者抑制前者而不发光；当有靶基因存在时，在PCR复性阶段，探针与靶基因互补，在PCR延伸中，由于Taq酶（一种耐热DNA聚合酶）具有5′-3′的外切酶活性，引物沿模板延伸至标记探针结合处，将5′端荧光发射集团切下，经激光照射产生荧光，在这时检测系统收集PCR扩增系统中荧光，其强度与PCR产物量成正比关系[3-5]。该技术以外标准作为定量依据，将即时检测荧光强度与标准曲线相比定量，最终反映原始模板定量[3]。该技术把基因扩增PCR、分子杂交和光化学融合为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果。该技术在整个扩增过程中保持在封闭状态下，不需PCR后处理，即不需将扩增后的PCR产物取出再进行结果分析，且在系统中又使用了尿苷酶（UNG酶）预防污染，极大降低了假阳性结果的发生率[6]。
２ FQ-PCR在病毒性肝炎诊疗中的临床应用
2.1 早期诊断
2.1.1 诊断乙型肝炎 临床上常用血清免疫学方法检测患者血清中乙型肝炎病毒的抗原或抗体，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是乙型肝炎病毒抗原的一种，一般通过测定患者血清中HBsAg即可明确诊断，不需要进行HBV核酸检测来诊断。但在某些情况下，患者血清中HBsAg用免疫学方法检测不到：①HBsAg抗原量过低，未达到检出水平；②出现乙型肝炎表面抗体（抗HBs），存在HBsAg与抗HBs复合物，抗体优势时HBsAg被掩蔽；③基因变异不产生HBsAg；④血清中单独HBV核心抗体（抗HBc）阳性等等。在以上各种情形下，血清中HBV DNA可能为阳性。HBV DNA是反映病毒是否复制的直接指标，HBsAg阴性而HBV DNA阳性表明患者存在现症感染。因此，FQ-PCR检测HBV DNA可用于血清中乙型肝炎病毒的抗原或抗体滴度低时诊断肝炎。
2.1.2 诊断丙型肝炎 目前临床上对丙型肝炎的诊断主要依靠血清标记物抗HCV的IgG抗体的检测，但此抗体只是间接反映了患者有HCV感染，其在体内不易被清除，持续时间较长，可维持在10年左右[7]，因此该指标不能区别是现症感染还是既往感染，即不能准确地反映病情。HCV在血液中复制水平低，血清中的病毒较少，抗体的产生较晚，一般在感染的第2周以后才产生抗体，通常存在有“窗口期”问题，而有部分患者因免疫力低下或使用了免疫抑制剂（如白血病患者），体内可能不产生抗体而造成漏检。血清HCV RNA是HCV感染的直接依据，是反映HCV复制的可靠指标，检测HCV RNA是目前唯一能直接检测病毒血症的方法[2]。杨东亮[8]研究表明，血清中的HCV RNA是病毒复制和肝炎进程的确切标志，检测血清HCV RNA已成为诊断HCV病毒血症的“金标准”，其定量分析法的特异性为98%～99%，且不受基因型的影响。因此，病毒核酸的检测在对丙型肝炎的诊断上更为重要。
PCR检测病毒核酸解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态从而做出早期诊断。
2.2 选择治疗药物和制定治疗方案
在肝炎病毒核酸定量研究中发现，病毒核酸的数量与某些药物的疗效相关，如干扰素对病毒高拷贝者不敏感，低拷贝者敏感，而有些药物如拉米夫啶则有显著降低病毒高拷贝的作用[9，10]；乙型肝炎急性期经贺普丁治疗后外周血HBVDNA含量显著下降，后改用干扰素治疗效果极佳[11]。丙肝的治疗要�及时�，就一定要依靠HCV RNA的定量检测，其检测意义除可确定感染外，还体现在用于指导治疗和判断应答[12]。
2.3 监测疗效及判断预后
外周血中HBV、HCV核酸的含量反映了病毒复制的活跃程度和患者病程变化，是衡量抗病毒疗效的重要指标。虽然乙型肝炎的诊断一般不需要进行病毒核酸的检测，但在对患者进行抗病毒治疗时，病毒核酸含量的检测显得必不可少，尤其是当HBV基因组前C区发生突变时，因妨碍了病毒e抗原（HBeAg）的分泌，导致患者血清中HBeAg阴性而HBV DNA却保持为阳性[13]，此时病毒核酸定量更能动态反映药物疗效。在乙肝治疗过程中，慢性肝炎治疗的终点是血清学标记即HBV DNA的消失。有关研究[14]发现，可以以HBV DNA血清浓度的变化来评价药物疗效与病毒载量的关系。动态监测患者外周血中的HBV DNA，当患者经抗病毒药物治疗后，HBV DNA含量持续下降，然后维持在较低水平，甚至低于方法检测下限，则表明治疗有效；如果经治疗后病毒载量下降不明显，则应考虑改变治疗方案[9]。研究表明[15]， HBeAg无论是阳性还是阴性对慢性乙型重型肝炎预后均无影响，而HBV DNA载量作为预测慢性乙型重型肝炎预后的重要因子，HBVDNA低载量患者预后较好。有研究[16]表明，治疗前病毒载量水平可作为慢性肝炎在用拉米夫啶治疗时发生的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸（YMDD）变异的早期预测指标，即治疗前HBV DNA水平越高，YMDD变异的产生率越高，产生变异的时间越早。
2.4 用于分子流行病学调查
HBV DNA的变异是客观存在的，在用拉米夫啶治疗慢性乙型肝炎时，HBV会发生变异导致抗病毒治疗失败，其主要是在HBVDNAP基因区发生了YMDD变异[17，18]。YMDD变异可以是天然存在的[19]，亦可以是在治疗时诱发引起的[16，20]，FQ-PCR可用于HBV YMDD变异[18]的检测，便于分子流行病学调查。
综上所述，FQ-PCR在乙型肝炎、丙型肝炎的诊断、治疗及疗效评价等方面有很大的应用价值。我国是深受肝炎病毒（尤其是乙型肝炎病毒）危害的国家，这类人群在接受治疗时需要有好的检验技术为临床提供选择药物及评价疗效的客观依据。目前而言，FQ-PCR能客观反映血液中病毒核酸的确切数量，基本上能满足临床这方面的需要，对肝炎患者选择药物及评价疗效具有积极意义。
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(收稿日期： 2007-02-15)
［责任编辑 王慧瑾 高莉丽］
