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【摘要】目的：探讨ELISA法检测乙肝五项的影响因素。方法：对我院采用ELISA法检测乙肝五项的试验进行回顾分析，总结试验影响因素。结果：ELISA法检测乙肝五项可能的影响因素为患者因素、实验操作因素、标本因素、试剂因素、ELISA试验特点等。结论：医务人员需严格按照规范操作进行试验，避免ELISA法测定乙肝五项中的各项影响因素，从而提高临床诊断灵敏度、特异性。
【关键词】ELISA；乙肝五项；影响因素
随着现代临床免疫学的发展，酶联免疫吸附试验（ELISA）因其操作简单、灵敏度高、特异性高等特点[1]。通常采用96孔酶标板作为固相来检测相应抗原、抗体。虽然操作简单，但可能由于人工操作的差异，检验过程中受到外界因素及人为因素影响较多，而易使检测结果出现误差。本研究从患者因素、实验操作因素、标本因素、试剂因素、ELISA试验特点等方面入手，简要探讨ELISA法检测乙肝五项的影响因素，报道如下：
1患者因素
以患者体内的非特异性干扰物质为主，常见的有：内源性酶、补体、类风湿因子（RF）[2]。人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF），能结合捕捉抗体与标记二抗的Fc段，从而出现假阳性结果。补体活化过程中，固相一抗及酶标二抗结合过程中，引起抗体分子变构，Fc的C1q分子结合位点暴露出来，C1q可将本不能结合的二者连接起来，引起假阳性。内源性酶对双抗夹心ELISA影响较小，用EDTA或NaN3・H2O2即可灭活酶。
2实验操作因素
ELISA实验操作包括包被、封闭、孵育、加样、洗涤、显色、比色。下面就这几个操作可能涉及的影响因素一一分析。
2.1包被：要求包被液pH值9.6的碳酸盐缓冲液，通常与酶标板中加入包被液，后放置于4°C冰箱过夜，也有学者主37°C保温2小时。包被最适浓度随载体及包被物的性质变化很大，需根据实验摸索与酶结合物的最适宜浓度。通常的蛋白质包被浓度100?g/ml-20?g/ml。选择包被液不恰当可能会造成蛋白包被不上，从而出现结果异常。
2.2封闭：为降低背景值的可选步骤。常用封闭剂为0.05%~0.5%的牛血清白蛋白，封闭是否必要，决定于ELISA模式及实验条件。一概盲目封闭可能会适得其反。
2.3孵育：采用水浴锅温育。避免阳性标本孔液体溅入阴性板孔而出现阴性标本的假阳性。应使ELISA板底贴水面，板上加盖，严格保证孵育的温度计时间，力求准确。孵育时间不够，温度不适宜均会导致抗原抗体无法结合，从而出现异常结果。
2.4加样：加样时应将样品加入ELISA板孔底部，避免加在孔壁，避免剪除，不可产生气泡。加样过程中不同浓度标本均应更换Tip头，以免发生交叉污染。加样为试验的关键步骤之一，加样的准确与否直接关系到读板OD值的大小，务必要保证加样量的准确。
2.5洗涤：洗涤不充分，无法分离游离与结合的酶标记物，无法清除残留在酶标板中未能与固相抗原或抗体结合的物质。为决定试验成本的关键所在。操作者应严格按照规范操作进行，不得马虎了事。洗涤液加注时以很大冲力猛冲，会导致包被于固相载体表面的成分脱落而出现HBsAg、HBsAb、HBeAg假阴性及HBeAb、HBcAb假阳性。
2.6显色：影响显色的主要因素为温度和反应时间。一定时间内，阴性、孔为无色，阳性孔随时间延长颜色逐渐加深，适当提高温度可加速显色进行。显色时间不够，温度过低，会导致显色反应发生情况不理想，于既定时间测得吸光度值过低，从而出现假阴性结果。
2.7比色：比色前需用洁净的吸水纸擦干板底液体，然后放入酶标仪中，选择合适的波长测定。比色波长设置不当，会导致测得吸光度值与实际值差异很大，进而影响实验结果的判断。
3试剂因素
3.1选择合适的试剂试剂盒的质量关系到ELISA法检测结果的准确度。而不同厂家生产的试剂其灵敏度、特异性存在一定差别，有报道指出[4]，调查的8个厂家抗HGV-IgG试剂盒检测结果37.5%不合格。通常应选择知名度高、效果好、证件齐全的试剂，不要用无批号的试剂，尽量选择与仪器配套的试剂。禁止使用过期试剂及混用不同批号的试剂。好的试剂是试验成功的一半保证。
3.2试剂的准备临床实验通常将试剂从冰箱中即拿即用，试剂往往未达到适合温度即参与反应，往往导致反应时间不够，对于一些弱阳性标本检测出现假阴性结果。因此，试剂的准备应引起医学检验人员的重视，应先将试剂盒从冰箱中拿出，于室温下放置20~30min以平衡室温，进而满足后续测定需求。
4ELISA试验特点
4.1边缘效应ELISA试验过程中，酶标板在室温、温育条件下反复转换，使板中央与周边温度升降不平衡，导致中央孔与周边孔结果上的差异。这种差异对临界值标本结果判定产生严重影响，使用全自动酶免疫可以克服。
4.2钩镰效应双抗夹心ELISA试验中，抗原量过剩及标记二抗介导抗原分子变构产生抗原过多，均可导致吸光度值过低而出现假阴性。样本稀释至合适浓度可以解决此问题。
综上所述，影响ELISA检测乙肝五项的因素众多，我们需要从提高试剂质量、检验人员自身素质、加强科室质量管理等多方面入手，方可提高ELISA检测结果的准确度，避免误诊、漏诊的发生。
参考文献
[1]周先碗，胡晓倩.生物化学仪器分析与实验技术[M].北京：化学工业出版社，2002:274.
[2]韩凤，王淼.ELISA法检测乙肝五项干扰因素和防控措施的探讨[J].中国中医药咨讯，2009,1（5）：146.
[3]宋艳，赵伟，王云.乙肝五项检查过程中值得注意的几种因素[J].中华临床医学研究杂志，2006,12（20）：2811.
[4]马达，郭乃洲，王惠民.8种抗HGV-IgG试剂盒检测结果比较[J].临床检验杂志，1998,16（1）：36-37.
