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郁东伟 冯月娟 施 凯 刘英君 李 力 王 剑
肺癌目前是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，除靶向治疗、化疗、免疫治疗等现代医学治疗手段外，中医依据辨证论治在肺癌诊治中发挥其独有的特色。其中舌诊是辨证论治的重要手段。快速现场评价（rapid on-site evaluation，ROSE）是利用快速染色技术，对穿刺的标本在现场进行制片、染色，进而在显微镜下对细胞学或微生物学进行判读，评价是否取到了所需要的标本、标本是否充足、质量是否满足诊断要求[1]。其目的是保证穿刺诊断的准确率，减少不必要的穿刺操作，从而节省时间，减少患者的痛苦和风险[2]。本研究拟将ROSE 结合到中医舌诊中，对肺癌患者的舌苔脱落细胞形态学及微生态进行分析，为肺癌舌诊提供客观理论依据。
1.1 一般资料 纳入2020 年9 月至2021 年6 月杭州师范大学附属医院收治的58 例肺癌患者，根据分期不同，分为Ⅰ～Ⅱ期肺癌组26 例、Ⅲ～Ⅳ期肺癌组32 例。对照组28 例为杭州师范大学附属医院健康体检人员或健康职工，中医辨证无明显的寒热虚实证候。本研究通过医院伦理委员会批准。
1.2 纳入标准（1）所有患者经病理学诊断为肺癌，依据美国联合癌症分类委员会（AJCC）和国际抗癌联盟（UICC）2018 年制定的TNM 分期[3]，由两名主治医师以上职称的呼吸内科中医师共同辨证；
患者舌象的辨别参照《中医诊断学》[4]；
舌苔脱落细胞分类标准参照《中医诊断实验方法学》[5]。（2）年龄18～75 岁；
（3）签署知情同意书。
1.3 排除标准（1）严重凝血功能障碍；
（2）出血倾向；
（3）有口腔疾病者。
1.4 检查方法 均在晨起时采集标本，采集标本前不进食及饮水。采集前清水漱口1 次。一次性棉签用生理盐水沾湿后，在被检者舌面中后1/3 处刮涂5次，然后在玻片涂抹直径约1 cm 的圆形，厚薄适中，所有标本一式两份。
1.5 标本处理 迪夫快速染色法[6-7]：将所制的玻片先于迪夫A 液中浸泡约20 s；
再于磷酸盐缓冲液中轻轻洗涤5 s，甩干缓冲液；
再把玻片完全浸于迪夫B液15 s；
最后清水染缸中水洗5 s，擦干玻片底部后于普通显微镜下观察。
1.6 评价标准 由2 名经验丰富的细胞学或检验学医师观察细胞或细菌成分及形态，进行综合分析。镜下观察并记录各层舌苔脱落细胞的百分比，分别计算各层细胞数、成熟指数（maturity index，MI）、成熟价值（maturity value，MV）。MI：即底层/中层/表层的细胞数分别与观察中的100 个细胞比值，体现了舌苔各层细胞组成及成熟情况；
MV=底层细胞数×0+中层细胞数×0.5+表层细胞数×1，体现了舌苔脱落细胞成熟的趋势[8]。
1.7 统计学方法 应用SPSS 23.0 版软件分析。符合正态分布的连续变量采用参数检验，并以均数±标准差（）表示；
不符合正态分布的连续变量采用非参数检验，并以中位数（下四分位数，上四分位数）[M（P25，P75）]表示。对于分类变量，计算每个类别中患者的百分比，以例（%）表示。组间比较通过卡方检验、Fisher"s 检验或非参数检验。诊断符合率采用Kappa检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 三组一般资料比较 三组性别、年龄分布比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Ⅰ～Ⅱ期肺癌组与Ⅲ～Ⅳ期肺癌组病理结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
表1 健康人群与肺癌人群基本资料比较
2.2 不同分期肺癌患者和对照组舌象比较 对照组和Ⅰ～Ⅱ期肺癌组患者舌质以淡红舌、红舌多见，舌苔以淡薄苔多见，Ⅲ～Ⅳ期肺癌组舌质以趋向红舌、绛舌多见，舌苔以趋向腐腻苔、白厚苔、光剥苔多见，统计结果表明Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者更容易出现红舌、厚腻苔，见表2-3。
表2 不同分期肺癌患者和对照组舌质比较[例（%）]
表3 不同分期肺癌患者和对照组舌苔比较[例（%）]
2.3 不同分期肺癌患者和对照组舌苔菌落比较 使用Fisher 精确概率法计算P 值，结果表明Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者容易出现杆菌及真菌菌落（P＜0.05），球菌为所有病例均可见，考虑为正常口腔定植菌，见表4。
表4 不同分期肺癌患者和对照组菌落比较（例）
2.4 肺癌患者和对照组舌苔及镜下表现 对照组舌质以淡红舌、红舌常见，舌苔淡薄，镜下背景洁净，细胞数量丰富，成熟度高，可见少量散在球菌；
而肺癌组患者舌质以红舌、绛舌多见，舌苔常厚腻或光剥，镜下背景较脏或者污秽，细胞数量丰富或较少，较极端，成熟度偏低，可见大量成团球菌、杆菌，部分患者可见真菌，见图1-4。
图1 健康人群舌象（迪夫染色，×200）
图2 肺癌患者舌象（迪夫染色，×200）
图3 肺癌患者舌象（迪夫染色，×200）
2.5 不同分期肺癌患者和对照组舌苔脱落细胞MI、MV 比较 使用单因素方差分析计算不同组间脱落细胞的MV，结果表明，肺癌分期越晚，表层脱落细胞越多，中层脱落细胞越少，MV 越低，组间对比差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。
表5 不同分期肺癌患者和对照组舌苔脱落细胞MI、MV比较（）
表5 不同分期肺癌患者和对照组舌苔脱落细胞MI、MV比较（）
注：MI 为成熟指数；
MV 为成熟价值；
“-”表示无法计算
图4 肺癌患者舌象（迪夫染色，×200）
舌诊是中医学四诊中望诊的重要组成部分。舌乃脾之外候，苔乃胃气之熏蒸，舌苔的厚、薄、黄、白等特征能反映疾病的不同发展，舌苔的厚薄变化、干燥湿润反映了机体正邪的消长、津液的盈亏和输布、脏腑运机变化[9]。研究表明，舌苔是由脱落的角化上皮细胞、唾液、细菌、食物碎屑及渗出的白细胞等多种成分组成[10]。舌上皮细胞的分化、成熟、脱落过程与舌苔的厚薄密切相关，如人体代谢正常，舌上皮细胞成熟、脱落顺利，舌苔表现为淡薄适中；
如人体代谢障碍，舌上皮细胞脱落困难，则形成厚腻苔[8]。此外，舌苔菌群的种类、数量变化可能与疾病的发展密切相关。周俊琴和鲁琴[3]对140 例不同证型中晚期原发性支气管肺癌患者舌苔脱落细胞形态进行分析，不同TNM 分期的肺癌患者中医证型分布有差别，舌苔脱落细胞的改变与肺癌所表现的中医证型有关。肖飞等[11]对肺癌患者的舌苔菌群进行研究检测，结果发现相同舌苔类型的不同样本之间有较高的相似性，舌苔质地及颜色相同者其菌群构成相似，提示舌苔类型与菌群结构相关。
然而上述研究存在一定不足，例如使用常规病理染色方法耗时较长，需等待24 h，不能及时将信息反馈给中医师和患者；
病理结果需专业病理科医师判读，但不能同时对微生物进行判读，需检验科医师协助；
常规病理染色通常不能对微生物进行固定染色，玻片上没有微生物存在，忽视了微生物的重要性。国内舌苔菌群的研究手段通常使用基因测序技术，价格昂贵，另外由于是基因测序，灵敏度高，微量污染后混入的基因可能造成结果失真。此外，基因测序失去了第一手资料的掌握，不能现场对菌落的形态、数量进行统计。
ROSE 是一种快速染色技术，目前在呼吸内科介入操作中应用较多，结合不同染料，可对细胞及微生物（包括细菌、真菌、结核）进行快速染色，从而实现现场快速判读，耗时1～2 min。研究表明，肺科医师经过3 个月的细胞病理学知识培训后，ROSE 判读的准确率可达80%，与病理科医师相比（准确率92%）无统计学差异[12-13]。而舌苔脱落细胞、菌群相较肺部而言种类单一，经过一定时间培训应能较快掌握对舌苔脱落细胞和菌群的识别。课题组前期已开展肺部ROSE 研究，积累了丰富的ROSE 经验，尝试将ROSE 应用于中医舌诊，期望将其用于现场判读，床旁协助中医师诊断。我们的研究结果显示，90 个病例的标本经迪夫染色法固定、染色均可获得满意图像结果，细胞和细菌均可很好地保存在玻片上，表明这一方法应用于中医舌诊是可行的。进一步深入研究发现，健康体检者和Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者舌质以红舌、淡红舌、淡薄苔为主，Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者以红舌或绛舌常见，以淡薄苔、白厚苔甚至腻腐苔为主，部分为光剥苔。镜下结果显示，健康体检者和Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者细胞成熟度较高，细胞数量丰富，背景干净，细菌分散，数量偏少。Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者细胞数量较多或极少，细胞成熟度较低，背景污秽，细菌极多、成团，部分患者可见真菌菌丝及真菌孢子。这或可解释为肺癌患者机体津液亏虚，生气不足，气机不畅，故舌苔厚腻或光剥，脱落细胞难以成熟脱落，邪气滋生，故菌群紊乱，甚至出现真菌情况，提示机体免疫力低下。这些结果凸显了机体正邪消长、津液盈亏和输布、脏腑运机与舌苔密切相关，体现了中医理论的正确性。本研究也存在一些不足，如研究病例少，单一迪夫染色不能区别菌群种类，我们将在今后结合更多染色技术，进一步探索舌苔菌群与肺癌的相关性，弥补单一迪夫染色的不足。
综上所述，Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者的舌苔脱落细胞、舌苔菌群与健康者、Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者不同，具有特征性。ROSE 操作简单、快速，可用于中医舌诊，为今后中医诊断标准化、精准化提供理论依据。
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