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摘要：［目的］ 用脉冲凝胶电泳方法绘制德尔卑沙门菌的DNA 指纹图谱，为研究德尔卑沙门菌的同源性提供分子生物学技术依据。 ［方法］ 从本实验室在各类食品中分离到的12株德尔卑沙门菌中提取DNA，经过限制性内切酶ba1的切割，再用脉冲凝胶电泳仪进行DNA分子分型，并使用Quantity OneTM软件对其同源性进行分析比较。
［结果］ 实验得到10株菌的DNA指纹图谱，与2003年D1号菌株遗传基因密切相关的菌株占22%；与2004年D15号菌株遗传基因密切相关的菌株占44%；2005年的4株菌中有3株之间的遗传基因密切相关；2006年的4株菌，分别为2株之间的遗传基因密切相关。
［结论］ 脉冲凝胶电泳方法是分析引起食源性疾病的致病菌的同源性的有效方法。
关键词： 德尔卑沙门菌；脉冲凝胶电泳；同源性；相似系数 中图分类号：R117文献标识码： Ａ
Molecular subtyping of almonella Derby by PFGE
WANG Ying, GU Qi-fang, CHEN Min, LIU Cheng, ZHANG Mei-ying, ZHOU Pei-jun （Department of food safety, hanghai Center for Disease control and Prevention, 200336,china）
Abstract)： ［Objective］ To draw a “fingerprint” of almonella Derby by PFGE, for researching the source of one of the foodborne disease-causing bacteria.
［Methods］ Cut DNA of bacteria using restriction enzyme ba1 and running the gel �using Chef Mapper(Bio-Rad. Analyze the source of these strains using software-Quantity OneTM.
［Results］ Compared with D1, 22% strains had close relationship with it, Compared with D15, 44% strains had close relationship with it. Among the 4 strains from 2005, 3 strains had close relationship respectively, among the 4 strains of 2006, 2 strains had close relationship respectively.［Conclusion］ PFGE is a very useful method to analyze the source of foodborne disease― the causing bacteria.
Key words)： almonella Derby；Pulsed-field gel electrophoresis(PFGE；ource similarity; imilary coefficient
自1888年，Gartner从一起因集体食物中毒而死亡的死者中分离到沙门菌以来，确认沙门菌的致病性已有一个多世纪［１］。当今，沙门菌引起的食物中毒仍然威胁着世界人民的身体健康，每年造成数千万美元的经济损失。
2003～2006年，我们实验室从各部位生猪肉中检测到12株德尔卑沙门菌（al. derby）。传统的生化、血清学方法只能鉴定到沙门菌的血清型，而对于同一血清型的不同菌株的分析比较却无能为力［2］。为了分析比较从不同食品中分离到的同一血清型的沙门菌在分子生物学水平的异同，本实验室采用脉冲凝胶电泳方法对这12株德尔卑沙门菌进行DNA分型和指纹图谱的比较，并且分析其同源性，为研究德尔卑沙门菌引起的食源性疾病提供分子生物学水平分析数据。��
1材料与方法�
1.1 材料�
1.1.1 菌株 2003～2006年从猪的各种部位检测到的德尔卑沙门菌共12株，编号见表1。��
表12003～2006年从各类食品中�检测到的德尔卑沙门菌的编号�
1.1.2 试剂 本实验方法所用试剂有营养琼脂斜面（上海市疾病预防控制中心培养基室）；1M Tris-HCl pH7.6; 0.5M EDTA pH7.6；细胞悬浊液（10ml 1MTris-HCl pH7.6, 20ml 0.5M EDTA pH7.6，加纯水至1000ml，高压灭菌）；细胞裂解液（25 ml 1MTris-HCl pH7.6, 50ml 0.5M EDTA pH7.6，5g十二烷基肌氨酸钠（igma公司）,加纯水至500ml，不可高压）；TE Buffer(10ml 1MTris-HCl pH 7.6, 2ml 0.5M EDTA pH 7.6 加蒸馏水至1000ml；蛋白酶K（默克公司，反应的终浓度为0.5mg/ml），ba I （Promega 公司，切割位点)：5’…T�CTAG A…3’和3’ …A GATC�▲T…5’），Lamda DNA marker (Promega 公司,分子量为50kb～800kb, Agarose prep（为低溶点琼脂，使用浓度为2%, Pharmacia公司）, 跑胶用琼脂粉（使用浓度为1.2%, BIO-RAD 公司）， 10×TBE（使用浓度为0.5×JBE，BIO-RAD 公司）； 蒸馏水；EB染液。�
1.1.3 主要实验仪器 水浴摇床及水浴箱（37℃～54℃）；脉冲凝胶电泳仪；凝胶成像及分析系统（BIO-RAD 公司）；VITEK-AM全自动微生物鉴定仪；MINI VIDA；VITEK 比浊仪（生物梅里埃）。�
1.2 方法�
1.2.1 胶块的制备 经生化和血清学鉴定，确认为德尔卑沙门菌的纯培养菌株，接种于营养斜面，于37℃培养20h，然后将其悬浮于细胞悬浊液中，制成浓菌液，将菌悬液的OD值调整到3.6～4.5之间，在56℃水浴中放置10～15min，然后与2%的Agarose prepTM混合（在加琼脂的时候，2%的Agarose prepTM一直存放于56℃水浴中），灌注制胶模型，制成含菌胶块。�
1.2.2 胶块的洗涤 用蛋白酶K消化胶块（将蛋白酶K溶解于细胞裂解液中）， 置于54℃水浴摇床2h，然后分别用蒸馏水和TE Buffer洗涤各3次，条件为50℃水浴10～15min，洗涤后保存于TE中，储存温度为4℃。�
1.2.3 DNA酶切 把胶块切割成2mm左右厚的薄块，用限制性内切酶ba I（90U/每个胶块），对胶块中的细菌DNA分子进行切割，置于37℃水浴摇床3h。�
1.2.4 电泳 将酶切后的胶块放置于15孔胶梳上，同时放置Lamda DNA marker作为分子量标记。电泳条件设置为3～60s，19h，温度为12℃，电压为6V，线性程序，运行角度为120°，初始电流为300mA以下。电泳液为0.5×TBE。�
1.2.5 染色 电泳结束后用EB溶液染色30～45min，然后用蒸馏水脱色1h，中间至少换一次蒸馏水。�
1.2.6 DNA成像及分析用BIO-RAD脉冲凝胶成像系统将电泳后的结果在UV条件下拍摄下来，用Quantity OneTM分析软件对电泳后的条带进行同源性分析。��
2结果
经电泳和染色后，使用BIO-RAD凝胶成像分析系统拍摄12株德尔卑沙门菌的DNA指纹图谱，其中第2和第7泳道的菌株DNA未有效分离，不能用于分析，见图1。��
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图1 12株德尔卑沙门菌的DNA指纹图�
Lane 1)：D1; Lane 2)： bad; Lane 3)：D15; Lane 4)： D37; Lane 5)：D38; Lane6)： D39; Lane7)： λ DNA MARKER; Lane 8)：D40; Lane9)：D41; Lane10)： bad; Lane 11)： D43; Lane12)： D44; Lane 13)： D45 �
用Quantity oneTM分析软件对有效分离的10株德尔卑沙门菌的DNA指纹图谱进行DNA同源性分析，结果见图2、图3、表2、表3。�
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图2 10株德尔卑沙门菌DNA相似度百分比�以D1为参照，序号表示泳道的编号（Lane）�
�图3 10株德尔卑沙门菌DNA相似度百分比�以D15为参照，序号表示泳道的编号�
表22005年德尔卑沙门菌菌株DNA的相似系数�
3 讨论
常规电泳的方法，对大小超过30kb的DNA片段不能有效分离，因为片段太长，在电场作用下会延伸得太宽。1984年，chwarts和Cantor发明了解决这个问题的方法，当电场按不同的方向转换时，DNA以阶梯式的方式在凝胶中运动。因此，这种电泳被称为脉冲凝胶电泳。当凝胶被加载第一个方向的电场时，DNA会在电场的方向上拉伸，开始在凝胶中迁移。随后，根据运行的参数，第1个方向的电场会被转换到第2个方向。此时，DNA必须改变构向，在第2个电场方向重新定位后再迁移。只要以相同的电压和脉冲时间转换电场，DNA在凝胶中会笔直地顺着凝胶迁移［３］。
提取如此大的DNA，传统的抽提方法会造成DNA在抽提过程中断裂，从而无法保证脉冲凝胶电泳结果的可靠度。因此，将整个细菌细胞包埋在琼脂糖中进行溶解和去蛋白来获得完整的DNA，是一个切实可行的方法。但是，对于包埋用的琼脂糖要求非常纯净,具有很低的熔点，并且具有很高的强度、电泳迁移率和排阻限，同时应具有高分辨能力，这种低熔点的琼脂可具有对≥1000bp的DNA片段的高分辨能力。
本实验中，第2和第10泳道的菌株DNA未被成功分离，其原因主要是)：①蛋白酶K没有或没有充分使细菌去蛋白，以至于细菌的DNA 没有从细胞中释放出来，这可能是由于胶块粘在管壁上未与蛋白酶K消化液接触；②限制性内切酶ba1在相应位点上没有成功地进行酶切，以至于在电泳过程中无法成功地将DNA片段“跑”出来，这可能是由于胶块粘在管壁上未与限制性内切酶ba1接触到，或者是由于酶的效价降低。在今后的实验中应该注意检查，确保胶块浸泡在溶液中，若非此原因造成，则应适当增加限制性内切酶ba1的浓度和酶切时间。
用Quantity oneTM分析软件对这10株菌的同源性进行分析，用百分数以及相似系数（相似矩阵的形式）表示它们之间的相似程度。
由图2可见，有22%的菌株与D1的相似度≥75%。由图3可见，有44%的菌株与D15的相似度≥75%。当菌株之间的差异为2～3个条带，这可能由于偶然的单一基因事件的改变，如点突变、插入或DNA缺失，它们遗传基因紧密相关，流行病学上可能密切相关。如果菌株之间的差异在 3个以上条带，这可能与插入、DNA缺失、限制性内切酶位点的获得或缺失有关，这些菌株之间遗传基因不紧密相关，流行病学上也不大可能相关［2,4,5］。
表2、表3以相似矩阵形式，分别表示2005年和2006年德尔卑沙门菌菌株之间的相似度。由表2的分析可以看出，D37、D38、D39三个菌株条带之间的遗传基因密切相关，D40与它们不密切相关。由表3的分析可以看出，D41和D43两株菌株之间的遗传基因关系比较密切，D44和D45两株菌株之间的遗传基因关系比较密切。
通过一系列的实验和分析，脉冲凝胶电泳方法能清晰地绘制出德尔卑沙门菌的DNA 指纹图谱，并且通过Quantity OneTM软件能直观地将菌株的条带分型，是分析食源性致病菌同源性的实用方法。
1993年，在一起爆发于美国西部的严重的食源性疾病事件中，美国CDC的科学家采用PFGE方法绘制细菌的指纹图谱，成功确定了从病人体内检测到的菌株与一家大型快餐连锁店供应的汉堡肉馅中检测到的菌株具有相同的PFGE类型。从而迅速确认了这一爆发事件，并避免了可能发生的更大规模的爆发事件。如今，PFGE方法已经被欧美多国的公共卫生实验室的科学家所采用，通过这一方法，能快速对来自病人的菌株 进行PFGE指纹图谱分型，从而确定病人菌株之间的相似程度。
PFGE分型方法也有局限性，完成这一方法需要较长的时间，并且对实验操作的技能要求较高，不同的操作者使用同样的试剂和仪器，得到的图谱清晰度可能会有较大的差异。
(感谢中国疾病预防控制中心流行病研究所金东、许彦梅老师的指导��
4 参考文献�
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