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摘要：对转基因乳清白蛋白的研究已有近20年的历史。文章综述了转基因乳清白蛋白的生理作用和安全性。阐释了转基因乳清白蛋白的三大生理作用，即影响后代生长特性，改善睡眠、抗焦虑、提高认知能力和抗肿瘤作用。重点分析了产生这些生理作用的原因。概述了研究者根据实验得出的安全性评价结果，同时介绍了系统的安全性评价所包含的内容，并以美国提出的组成成分分析方法作为补充。
关键词：α-乳清白蛋白；转基因动物；生理作用；安全性评价
随着各种克隆技术（如显微注射法、体细胞核移植技术、胚胎干细胞法、反转录病毒法和精子载体法等）的日趋成熟，转基因动物反应器在食品、医药、工业等领域的应用变得更加现实。其中动物乳腺生物反应器是近20年来受到大家关注的领域之一。乳腺是专门化的分泌腺体，其表达的产物经转录后修饰具有生物活性，且产量高、活性稳定，不污染环境。通过转基因技术可实现所转入的α-乳清白蛋白（α-lactalbumin, α-LA）基因在受体动物乳腺的高效表达，并作用于机体改变乳成分和泌乳量，最终影响后代的生长特性。
在利用动物乳腺生物反应器表达转基因α-LA的研究中，大部分是将牛的α-LA基因转移至该基因敲出小鼠，仅小部分是关于如何构建人α-LA基因植物表达载体（如转人α-LA基因番茄）。近年来亦有将牛α-LA基因转移至猪或羊的研究，但仍较少。这主要是由于低且随机的基因整合，来源少且存活率低的活体胚胎及实验探索中的巨额花费限制了将转基因技术应用于大型家畜[1]。随着相关技术的逐渐成熟，目前通过体细胞核移植技术和自然繁殖技术已成功获得了牛乳腺生物反应器，该生物反应器可生产人α-LA。中国农业大学在国际上首次获得了整合有“人乳铁蛋白”和“人α-LA”基因的克隆牛，并已经开发出与人乳成分相近的人乳化牛奶。
应用转基因技术获得的目的蛋白具有成本低、产量高和生物活性稳定等特点，可用于营养保健品和婴幼儿配方产品等方面，应用前景不容置疑，但对其生理作用和安全性的系统评价目前仍欠缺，而这正是相关研究成果的推广应用所必须的。因此，对这方面的研究将显得尤为重要。
1转基因α-LA的生理作用
1.1影响后代生长特性
研究表明转基因α-LA可影响后代的生长特性，使之呈现更快的生长速度。这主要源于两方面的原因。首先，外源α-LA基因的转入使该蛋白在泌乳早期表达总量增加，从而使乳糖合成相应增强，后代因此摄入更多的碳水化合物。其次，乳糖含量的增加使乳汁的粘度下降而使其更易泌出，最终使泌乳量增加。
1.1.1转基因α-LA 的高效表达使乳糖合成量增加
α-LA是二磷酸脲苷-半乳糖基转移酶（uridine diphosphate-galactosyl transfer-ase, UDP-GT）的调节亚基，二者形成异二聚体复合物乳糖合酶。UDP-GT可催化二磷酸尿苷-半乳糖的半乳糖基转移至含有低聚糖β-N-乙酰氨基葡萄糖的糖蛋白上[2]， α-LA连接到UDP-GT上并增加UDP-GT对葡萄糖的亲和力和特异性使米氏常数降低，从而使乳糖合成可在生理条件下进行[3]。1997年Stacey等[4]的研究进一步证实了α-LA对于调节乳腺上皮细胞中乳糖的合成起着至关重要的作用[5]。该研究通过靶基因技术制成α-LA基因敲出小鼠，结果发现该鼠分泌的乳汁中乳糖含量极少，有的甚至完全缺乏[4]。
研究表明当在非α-LA基因缺陷的动物中转入新物种的α-LA基因时，受体动物会同时表达内源基因和转入基因。转入基因表达的蛋白在泌乳初期含量较高并使得该蛋白总量增加。如2001年Wheeler等[2]将牛α-LA基因转移至猪中，该研究发现表达的牛α-LA含量在泌乳初期是猪α-LA的4.3倍，这使得α-LA总量增加[6]。Bleck等[7]的研究发现整合有牛α-LA基因的转基因鼠所表达的蛋白总量比对照组多5～15倍[7]，与上述观点相符。泌乳早期转基因组的乳糖含量（3.8%）与对照（2.6%）比较更高表明总α-LA含量增高可促进乳糖的合成。乳糖的主要作用是作为碳水化合物为机体供能。转基因动物在泌乳早期更高的乳糖含量可使后代摄入更多的碳水化合物。
1.1.2乳糖合成量增加可促进泌乳
研究表明泌乳量与乳糖合成量是直接相关的。2001年Wheeler等[6] 将牛α-LA基因整合到非α-LA基因缺陷的猪中。该研究发现转基因猪所产的奶中α-LA和乳糖含量均高于对照，且产奶量在3～9天比对照高20%～50%[6]。同年，Bleck等将牛α-LA基因转移至非α-LA基因缺陷的鼠中，该研究也发现乳糖含量和泌乳量均高于对照[7]。
造成这一结果是由于乳糖是乳汁的三大营养成分（即乳糖、蛋白和脂肪）之一，因而也是调控乳渗透压的主要因子。乳糖缺乏会导致粘度增高，妨碍乳汁的移出。而乳糖合成量增加可降低乳汁的粘度使其更易泌出，最终使泌乳量升高。因此，外源α-LA基因转入不仅直接影响受体动物的乳糖合成，而且也间接地促使泌乳量增加。而乳糖含量和泌乳量的上升均可使后代呈现更快的生长速度。
1.2改善睡眠、抗焦虑和提高认知能力
α-LA的氨基酸组成涵盖了人体营养所需的大部分必需氨基酸（如色氨酸、半胱氨酸、亮氨酸等，约占总氨基酸量的64.2%）。其中5.9%为色氨酸，色氨酸是神经递质5-羟色胺的前体，是调节神经发育、睡眠、食欲和情绪的重要因子，增加饮食中的色氨酸可改善睡眠[8]。
2000年Markus等[9]的人群实验表明高α-LA饮食可升高高度应激敏感（high s-tress�vulnerable, HS）组的血清素水平，降低皮质醇水平，从而起到抗焦虑和改善情绪的作用[9]。Hiroshi等[10]在2004年时通过动物实验印证了这一作用，并指出α-LA的这一作用具有剂量依赖性 [10]。
2002年Markus等[11] 的研究显示高α-LA饮食可提高HS组的认知水平。生化分析发现摄入高α-LA饮食的HS组血浆中色氨酸与长中链氨基酸之间的比例增加，该比例可作为反映色氨酸和血清素水平的间接指标。因此高α-LA饮食的抗焦虑和提高认知能力的作用可能均是与血清素有关的 [11]。虽然该作用机制还需要更深入的研究，但由于实验采用的是严格的双盲和对照设计，因此高α-LA饮食与抗焦虑和提高认知能力之间存在联系是比较肯定的。
1.3抗肿瘤作用
α-LA富含半胱氨酸和蛋氨酸。这些含硫氨基酸可增加骨骼强度和降低低密度脂蛋白胆固醇水平。半胱氨酸作为谷胱甘肽的重要组成分，能维持谷胱甘肽抗氧化系统活性[8]，因而可能具有防止化学诱发性癌症发生的作用。
2000年Svensson等[12]发现重组蛋白和来自于人乳的α-LA在油酸存在的条件下可通过改变空间构象转变为蛋白-脂质复合物的活性形式，即人α-LA致肿瘤细胞死亡（human α-lactalbumin made lethal to tumor cells, HAMLET）。通过共聚焦显微镜观察发现HAMLET可通过细胞质膜进入细胞核并逐渐聚集，最终使多种肿瘤细胞凋亡，包括L1210白血病细胞系、A498肾癌细胞系和A549肺癌细胞系等[12]。因而α-LA可能成为一种潜在的临床药物。
此外，α-LA可能还具有调理肠胃使营养物质被均衡吸收和加速伤口愈合的作用，但未发现有验证这方面作用的系统的实验。
2转基因α-LA 的安全性
2.1基于实验的转基因α-LA安全性研究
目前尚未发现有研究通过动物实验系统地评价转基因α-LA安全性。这是由于实验所用的受体动物大部分是小鼠，仅小部分是羊或猪。受体动物表达的转基因α-LA经纯化后产量少，难以满足动物实验中大量的样品需求。此外，以往的研究还处于对如何成功建立乳腺生物反应器的技术探索阶段，侧重点是该技术的可行性，尚不存在应用在人身上的可能，因此研究者可能更注重对转基因α-LA 的生理功能的探索和对影响该技术成功与否的关键问题的分析解决。
虽然关于转基因α-LA安全性的研究不多，但Wheeler等[2]的报告指出整合有牛α-LA基因的转基因猪表现出与对照相同的生长率和性成熟时间，其产仔和泌乳过程也正常[6]。1996年Bleck等[13]通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和蛋白印迹相结合的方法分析鉴定了在转基因鼠中表达的牛α-LA和β-酪蛋白，结果表明转基因牛α-LA和β-酪蛋白的分子量和天然蛋白相同，等电点和翻译后修饰过程也极为相似。通过高效液相色谱法分析发现转基因牛α-LA的N端氨基酸序列与天然牛α-LA相同[13]。
对重组蛋白的安全性评价应从该蛋白与天然蛋白的等同性分析入手，结合致敏性和蛋白毒性评价得出综合分析结果。上述研究者做了蛋白特性分析、翻译后修饰比价、蛋白结构和功能特性分析，但尚未测定该重组蛋白的免疫原性、致敏性和蛋白毒性，而致敏性更是安全性评价的关键因素。系统的安全性评价是保障这一研究成果推广应用的必要条件之一，而随着评价方法的逐步建立和重组蛋白产量的提高，对相关方面的完善将成为今后科研极好的研究方向。
2.2针对转基因动物终产物（奶）的安全性评价规范
目前尚未建立对动物重组蛋白的系统安全性评价标准。2006年美国食品与药品监督管理局（united states food and drug administration, USFDA）制定了《克隆动物的安全性评估规范》，其中的部分内容与动物重组蛋白具有一定联系。该规范针对转基因动物终产物（即所产的奶）的安全性提出了新的评价方法――组成成分分析法。该方法适用于奶和肉的安全性评价，但由于它们含有成千上万种化学物质，而这些化学物质在质和量上均受饮食、环境和遗传等因素的影响，试图鉴定所有的化学成分是不可行的。因此，分析工作仅能局限在含水量、蛋白、脂肪、碳水化合物、矿物质和灰分方面。如果有必要的话可分析一些特定的营养素、抗营养素、矿物质、脂肪酸和蛋白等[14]。组成成分分析虽然不是针对转基因α-LA的安全性评价方法，但由于该蛋白与牛奶密切的相关性，因此分析的结果仍可作为安全性评价的参考依据。关键生物系统是对转基因动物进行评价，共分五个阶段，类似于危害分析关键控制点（hazard analysis and critical control point, HACCP）[14]。
转基因动物安全性评价的相关规范较多，除了上述的法规外还有USFDA于1995年制订的《关于生产和检测来源于转基因动物的人用医疗产品的指导意见》 [15]和2009年颁布的《关于含有可遗传重组DNA结构的转基因动物的规范》等[16]。但这些规范仅介绍了转基因动物的安全性评价程序，尚未对于具体的评价方法做出细致说明。此外，规范中亦很少涉及动物重组蛋白的安全性评价。
3总结
经过对转基因动物的多年研究，外源基因的获取与转入、转基因动物的饲养与保健、目的蛋白的分离纯化及鉴定等实验技术已日趋成熟。转基因动物表达的α-LA具有成本低、产量高和活性物质稳定等特点，在食品、医药和工业等领域具有极佳的应用前景。转入的α-LA基因所表达的蛋白可起到影响后代生长特性，改善睡眠、抗焦虑、提高认知能力和抗肿瘤的作用。但目前仍欠缺对该蛋白生理作用和安全性的系统性评价，特别是安全性评价更是亟待完善的方面。这是将该技术推广应用的必要因素之一，也是成功的安全保障。
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