【www.zhangdahai.com--技术个人工作总结】
黄惠兴，陈明望，庄晓娜，郑嘉莹，李逸飞，李天宇通信作者
(1.中山市黄圃镇动物疫病预防控制中心，广东 中山 528400；
2.中山市动物疫病预防控制中心，广东 中山 528400；
3.广西大学，广西 南宁 530004)
鸡毒支原体(mycoplasma gallisepticum，MG)又称为鸡败血支原体，可以通过飞沫或垂直传播进入家禽体内，引起家禽产生呼吸道疾病[1]，并可使家禽淋巴细胞萎缩坏死，免疫器官受损，产生免疫抑制，容易与其他病原进行混合感染，导致死亡率增高，给全球家禽业带来巨大经济损失[2]。由于MG特殊的免疫逃逸机制，可在宿主体内长期存活，导致病禽终身带毒，且存在散毒风险。现阶段MG灭活疫苗和弱毒疫苗都存在一定的免疫缺陷，灭活疫苗免疫保护效果较弱；
弱毒疫苗免疫存在散毒和毒力返强的风险。在药物治疗方面，MG临床常用抗生素，但容易产生耐药性，进一步加剧了MG防控难度。本文针对MG病原学特点和流行特点，建议家禽养殖业优化管理模式，做好生物安全防控，培育优质MG净化鸡群。
鸡毒支原体是一种大小介于细菌和病毒之间的原核生物，无细胞壁，仅细胞膜包裹，唯一的细胞器是核糖体，鸡毒支原体细胞长度为250～500 nm。在电子显微镜下可观察到其呈现多种形态，常见的3种形态主要是球状、丝状和杆状。鸡毒支原体采用革兰氏染色着色效果较差，呈弱阴性，经瑞氏-姬姆萨染色液染色着色效果较好，呈淡紫色。鸡毒支原体对大环内酯类以及四环素类药物敏感，但易产生耐药性，对作用于细胞壁的抗菌药物(磷霉素、糖肽或β-内酰胺类抗生素)以及第一代喹诺酮类药物、磺胺类药物、多黏菌素、甲氧苄啶和利福平耐受力较强。对紫外线敏感，阳光直射就能使其迅速丧失活力，一般常用的化学消毒剂(含氯溶液、乙醇、乙醚、过氧乙酸等)能将其迅速杀死，50℃条件下加热20 min也能将其灭活。鸡毒支原体对鸡血红细胞具有很强的吸附性，这一特性常用于与非致病性禽源支原体鉴别诊断。
2.1 病理损伤
鸡毒支原体进入鸡体后通过其单极末端的泡状结构释放出细胞黏附素GapA、CrmA蛋白使其吸附到宿主气管黏膜上，同时利用微管透过黏膜将自身DNA、核酸酶注入到宿主细胞内，再利用宿主细胞营养物质进行大量繁殖，使气管纤毛细胞病变，纤毛运动能力逐渐丧失，气管内的异物以及黏性分泌物无法排出体外，会残留在肺泡和细支气管末端，逐渐导致肺小叶细胞坏死，肺部出现组织肉病变，造成鸡出现呼吸困难。并逐渐由呼吸道转移侵入到全身各个组织器官，病禽其他脏器也可见肝周炎、气囊炎和腹膜炎等。
2.2 免疫损伤
鸡毒支原体粘附在气管黏膜表面时其细胞膜表面的脂质相关膜蛋白(lipid-associated membrane proteins，LAMPs)与宿主细胞上Toll样受体(Toll like receptor ，TLRs)相结合，其中TLR2主要是介导诱导炎性因子释放、促凋亡和抗凋亡等[3]。鸡毒支原体能与TLR2受体结合通过膜通道蛋白将信号传递至宿主细胞膜内，引起免疫应答，使B细胞、T细胞以及单核巨噬细胞大量增殖，同时通过转导蛋白髓样分化蛋白88(myeloid differentiation factor，MyD88)和TIRAP(TLR containing adapter protein)依赖途径，使下游分子磷酸化，从而激活NF-κB(nuclear factor-KB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路，这2类通路可调控许多炎症相关基因的表达，并可影响炎症和免疫反应。NF-κB信号通路中激活NF-κB信号通路诱导激酶(NIK)，进一步激活核转录因子kappa B(NF-κB)，NF-κB由细胞质转移到调节基因表达的细胞核中，诱导下游炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL1β)、白细胞介素6(IL6)以及细胞凋亡相关基因表达，导致免疫细胞释放炎性细胞因子加速凋亡造成组织炎性损伤(见图1)。
图1 Toll-like receptor，NF-κB，MAPK 信号通路[4]
2.3 免疫抑制
当鸡毒支原体透过黏膜屏障后开始侵入非吞噬细胞以及巨噬细胞HD11，鸡毒支原体在感染HD11后鸡体抗氧化能力降低，引起细胞稳态失衡，破坏线粒体，释放线粒体DNA，并产生活性氧(ROS)，过量的ROS积累引发鸡体的氧化应激和异常的细胞凋亡[5]。吞噬细胞和淋巴细胞的数量改变以及结构破坏都会严重影响免疫器官的功能，在鸡毒支原体感染鸡体期间，会造成淋巴细胞的萎缩以及坏死，导致免疫失调，造成法氏囊、胸腺和脾脏等免疫器官受损，破坏了鸡的免疫系统，产生免疫抑制。
2.4 免疫逃逸
鸡毒支原体的基因中涉及表面抗原多样化的数量非常多，使得LAMPs可以以较高频率发生变异，特别是细胞粘附素可产生高度突变，使支原体可以逃避宿主产生的免疫应答，所以禽类一旦感染鸡毒支原体，将长期处于慢性应激状态，导致鸡体的免疫功能遭到抑制，使鸡毒支原体更容易达到免疫逃逸。
3.1 易感动物
鸡毒支原体可感染不同日龄的禽类，尤其鸡和火鸡最易感，其中幼龄鸡和纯种鸡的发病率和死亡率最高。MG感染成年鸡通常不表现出临床症状，呈隐性感染。然而幼龄鸡感染后通常表现为呼吸困难甚至肺炎等症状，严重可导致死亡，死亡率高达30%。MG一年四季均可发生，尤其寒冷季节感染率最高。
3.2 传播方式
MG的传播途径有两种方式，即水平传播和垂直传播，以后者传播方式为主。水平传播是指病原通过飞沫的方式进行空气传播，如咳嗽和喷嚏。此外，健康禽类接触污染的饲料、水及土壤也可感染。垂直传播是指带菌母鸡经蛋传播给雏鸡，或者带菌公鸡在交配时通过精液传播给母鸡从而使母鸡感染。
3.3 流行情况
1976年，鸡毒支原体首次在我国分离出来。1986年，冀锡霖等[6]对全国20个省(区)鸡场开展MG的流行病学调查研究，试验结果显示鸡群中MG的平均阳性率高达78.5%，表明MG在我国多个省份已经迅速传播，将严重影响我国养禽业的健康发展。2018—2019年，谢昊晋[7]采集江苏省未免疫鸡毒支原体疫苗的规模化鸡场血清样本3 112份血样，阳性率为55.27%。与此同时，2018—2019年，上海市连续监测2年养殖户专业户和散养户的鸡群MG血清抗体阳性率的感染情况，其中养殖户专业户MG抗体阳性率分别为79.46%(2018年)和81.65%(2019年)，而散养户MG抗体阳性率分别为50%(2018年)和59.49%(2019年)，由此看出养殖专业户的鸡群MG感染情况比散养户严重。
雏鸡感染MG后的主要临床症状为呼吸啰音、打喷嚏和咳嗽，鼻腔内有黏液性鼻液，往往会堵塞鼻孔影响呼吸。眼结膜潮红、流泪增多、眼睑肿胀。另外，病鸡食欲减退、精神萎靡、生长速度慢、体重减轻。
成年鸡感染MG后，临床症状类似于雏鸡，但相比雏鸡较为缓和。产蛋病鸡产蛋率下降，产软壳蛋，种蛋受精率、孵化率降低，孵化出来的雏鸡往往体质较弱。感染严重则还会出现肺炎、心包炎、肝被膜炎等[1]。
当MG感染鸡群后，容易引起鸡群继发大肠杆菌、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒混合感染，导致呼吸道症状加重，产生严重的并发症，导致鸡群死亡率增高，给养殖场户造成巨大的经济损失。
剖检发现鸡只的鼻孔、气囊、气管以及支气管中存在较多黏性液体或者卡他性分泌物，气管壁发生水肿，感染前期气囊膜变厚且呈灰白色不透明状，感染后期可见气囊壁上存在干酪样渗出物。蛋鸡剖检时可见输卵管炎症，与大肠杆菌混合感染时，可见纤维性心包炎和肝周炎。
5.1 病原分离
MG病原分离鉴定常用人工培养基(FM-4培养基、改良Frey液体培养基和PPLO培养基)、鸡胚、鸡组织培养物分离病原体。选用疑似感染鸡只的上呼吸道渗出液(气管、气囊或鼻窦渗出液等)，接种到改良Frey液体培养基中进行初步分离培养。待液体培养基颜色从玫瑰红初变为黄色时，用接种环接种到固体培养板上，待其成长为典型的“煎蛋”状菌落，挑起单个菌落再次接种到改良Frey液体培养基中并重复以上过程3次以上即可认为得到一株MG纯培养物。
将分离纯化后的待检培养液离心，取其沉淀物涂片，用瑞氏-姬姆萨染色液染色后，进行镜检。
MG的病原分离鉴定是诊断的金标准，但工作量大，耗费时间长，不适合应用于生产实践上的快速诊断和实时监测。
5.2 血清学检测
平板凝集试验(SPA)是应用最广泛的检测方法。其优点在于检测结果清晰、简便快速、成本低等，但会出现一些非特异性凝集反应，假阳性的概率较高。
血凝抑制试验(HI)检验血清中IgG抗体具有特异准确的特点，可以进一步证实SPA的检测结果。但HI的灵敏度较差，操作繁琐，试验时间较长，并且IgG抗体在病鸡感染后3周才能通过HI检测出阳性，因此HI诊断方法在生产实践中应用较少。
酶联免疫吸附试验(ELISA)与SPA相比，特异性强、结果易判断，适合大规模血清样品的检测；
与HI相比，敏感性虽然稍低，但特异性强。因此在当前推广规模化养殖、大批量样品检测的情况下，多通过ELISA进行检测。
5.3 分子生物学检测
聚合酶链式反应(PCR)与血清学诊断方法相比，灵敏度和特异性较高。
杨美等[8]根据MG和MS基因的特点设计合成特异性引物，优化PCR扩增条件，建立能够同时监测MG和MS的双重PCR方法。赵杰等[9]从常用引物中选出灵敏度最高的mgc2基因设计的引物建立MG套式PCR检测方法，扩增基因片段与GenBank中收录的相关序列同源性为98%，并且与大肠杆菌、沙门氏菌、鸡滑液囊支原体均无交叉反应。周云雷等[10]建立了基于MG中特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。
6.1 灭活疫苗
鸡毒支原体灭活疫苗的研制一般采用油乳剂作为佐剂，其具有安全、稳定等优点，但免疫保护存在缺陷。研究表明，蛋鸡在开产前8周免疫β-丙内酯灭活疫苗可以有效缓解鸡毒支原体感染引起的产蛋量下降的问题，同时可以降低垂直传播风险；
但感染后再免疫，对鸡毒支原体垂直传播没有抑制作用。
6.2 弱毒疫苗
常用的弱毒活疫苗主要有F株、TS-11株和MG6/85株疫苗。F株免疫保护效力强、时间久，可通过滴眼接种，不影响增重；
蛋鸡开产前8周提前接种F株疫苗，可以有效减少感染后气囊损伤和产蛋损失，降低垂直传播现象；
但F株毒力较野毒株弱，仍有一定反强致病风险，尤其商品火鸡易引起感染。TS-11株和MG6/85株疫苗的毒力相对F株较弱，但对已感染鸡的免疫效果不如F株；
同时TS-11株和MG6/85株的致病力较弱，分别通过滴眼和喷雾接种未感染鸡只，可较好地提供免疫保护，抵抗强毒株攻击；
蛋鸡开产前接种TS-11株和MG6/85株疫苗不会影响鸡的产蛋量。
6.3 生物技术
鉴于灭活疫苗免疫效果不佳，而活疫苗存在散毒和毒力返强等缺陷，在这样的背景下，生物技术苗应运而生。生物技术苗包括活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、亚单位疫苗和基因缺失疫苗等。多价疫苗联合开发不仅降低疫苗成本，同时解决了单一鸡毒支原体基因载体疫苗免疫原性差等缺陷，具有较大的应用前景。
7.1 抗生素治疗
除了接种疫苗，药物防治也是防控鸡毒支原体的有效途径。鸡毒支原体临床治疗主要是抗生素类药物，例如四环素、土霉素、泰乐菌素、庆大霉素、达氟沙星等均对鸡毒支原体均有一定治疗效果。临床上使用抗生素进行鸡毒支原体治疗需要进行药敏试验，选择敏感性高的抗菌药，并且避免长时间使用同种抗生素。
7.2 中草药治疗
由于常用抗菌药普遍的耐药性，不利于鸡毒支原体的临床治疗，因此，越来越多研究开始关注中草药在鸡毒支原体治疗中的应用。黄连、没药、桔梗等中草药由于具有天然、安全、无毒等优势，同时在抗炎和提高免疫力等方面有显著效果，目前已成为治疗和预防家禽鸡毒支原体感染的重要材料。有学者将虎杖、山药、三七等中药复方提取物应用于鸡毒支原体治疗上，有效缓解了感染后气囊损伤、减重等临床症状，其治疗效果优于泰乐菌素。有研究表明，以黄芪、明党参、麻黄等中药制成的复方中药粉可以减轻鸡毒支原体感染导致的气囊损伤，同时对鸡只有促进增重的效果。
8.1 优化管理模式
8.1.1 全进全出制
针对MG对外界环境抵抗力弱的特点，对每批次出栏的鸡舍开展清洁、消毒、干燥、空舍等一系列净化病原措施，可以有效防止新引进的鸡群感染，为场内和鸡群MG净化奠定了基础。
8.1.2 加强日常饲养管理
养殖场应贯彻“养大于防，防大于治”的理念，加强日常饲养管理工作。例如常为鸡群提供营养均衡的全价饲料，定期清理料管、料槽中的发霉饲料；
饲养密度合理；
夏季防暑，冬季保温；
鸡舍内环境卫生保持整洁，降低舍内粉尘和颗粒物含量，对MG病等一些呼吸道疾病的预防和治疗具有一定的辅助作用；
定期清理鸡舍排泄物以降低NH3浓度，避免因NH3浓度过高导致鸡群免疫力下降；
控制进出鸡舍人员数量，拒绝闲杂人员入舍，做好人员和器械进出鸡舍的消毒和清洁；
在免疫、转群等群体操作前7天，可在饮水中添加复合维生素等抗应激药物。
8.2 生物安全防控
8.2.1 合理选址
养殖场选址应满足以下条件：距离动物产品集贸市场500 m以上；
距离动物诊疗场所200 m以上；
养殖小区之间距离不低于500 m；
距离动物无害化处理场所3 000 m以上；
距离居民区等人口集中区域和主要公路、铁路等主要交通干道500 m以上。
8.2.2 疫苗免疫
目前，用于MG预防的疫苗主要分为弱毒苗和灭活苗。养殖场在使用弱毒疫苗进行滴眼等方法接种时，免疫时应注意疫苗是否均进入鸡群体内，接种完成后将疫苗空瓶和所有稀释并未用完的疫苗应进行灭活处理，同时消毒和清洗好免疫用具，以免发生污染和散毒。
8.2.3 疫病净化
要培育优质MG净化鸡群，关键在于引种时做好检疫工作，不从MG疫区或支原体感染严重的地方引种，从源头做好疫病净化工作，保证均为健康鸡群。此外，在日常的饲养管理过程中做好严格的生物安全措施，实时监测和定期检查场内是否存在阳性鸡，并针对阳性鸡进行淘汰、免疫或用药等处理。种禽场在种蛋孵化前应进行MG的专项检测，并对种蛋进行消毒处理，避免支原体通过鸡胚代代相传。
鸡毒支原体的预防和治疗至关重要。结合当前实际，疫苗接种仍是防治鸡毒支原体最有效的措施，针对灭活苗和弱毒疫苗现存的免疫局限性，可以考虑两种疫苗联合使用的方法，采取安全有效的接种程序，同时应加大对新型生物技术疫苗的研发力度，为鸡群健康保驾护航。药物方面，目前的抗生素耐药性和药残问题普遍存在，临床上除了要选择药敏性强的抗生素，还可以考虑联合用药的方法，如多种抗生素联合使用，防止加剧耐药性，预防继发感染。另一方面，应积极寻找替抗产品，逐步减少抗生素的使用，目前中草药治疗鸡毒支原体病的研究已取得一定进展，可进一步推广应用于生产实际。最后，广大养殖人员要秉持“养大于防，防大于治”的理念，切实提高饲养管理水平，严格落实生物安全防控措施，将鸡毒支原体的危害降到最低。
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