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【中图分类号】 R654 【文献标识码】 A 【文章编号】1185-1672(2007)-04-0299-04 摘要 目的 通过建立大鼠静脉自体静脉移植模型，应用甲硫氨酸脑啡肽（M－Enk）及其长效受体拮抗剂盐酸纳曲酮（NTX）观察M－Enk对内膜增殖的影响，并初步揭示其中的作用机制。方法 建立M－Enk、NTX及对照组三组大鼠自体静脉移植模型，并分别给药；于不同时期取移植静脉标本，做形态学观察、c-fos、c-myc免疫组化染色、Western blot半定量检测，最后对数据采用方差分析及q检验。结果 1. M－Enk组内膜厚度各时段较对照组明显降低，NTX组内膜厚度各时段较对照组明显增加；2. M－Enk组移植1～3天c-fos蛋白表达较对照组明显受到抑制，NTX组移植1～3天c-fos蛋白表达较对照组明显升高；3. M－Enk组移植1～2周c-myc蛋白表达较对照组明显受到抑制， NTX组移植后3天至2周，c-myc蛋白表达较对照组明显升高；4. Western blot结果与免疫组化结果基本相符。结论 血管移植后，创伤破坏了内源性M－Enk与其受体结合的自分泌环，诱发了c-fos、c-myc等早反应基因的表达，从而引起更多的迟反应基因的表达，最终形成血管内膜的增生。
关键词 甲硫氨酸脑啡肽；自体静脉移植；c-fos、c-myc基因；血管内膜增生
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 M－Enk（美国Sigma公司）；NTX（美国Sigma公司）；c-fos免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；c-myc免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程公司）。
1.1.2 主要仪器凝胶自动成像分析系统1D Kodak (UVP美国Bio-Rad公司)；SXB－1型手术显微镜（中国上海10×）；计算机图象分析仪（Real Time Image Analyzer,Luzex-F,日本）；250克左右，3个月龄Wistar大鼠90只，雌雄不拘（由中国医科大学动物实验中心提供）。
2实验方法
2.1 动物模型制作给药方法及标本收集 大鼠90只，随机分成3组，每组30只。按文献方法［1］，行颈静脉移植。术后分别向3组每天腹腔内注射：第一组M－Enk（10mg/kg）；第二组NTX（30mg/kg）；第三天生理盐水（0.2ml）做对照组。术后分别于1，3，7，14，28天取移植静脉，分为均等两份，一份常规甲醛固定，石蜡包埋；另一份-70℃保存。
2.2 标本检测
2.2.1 组织学染色 行HE染色，光镜观察，计算机图象分析仪分析血管内膜厚度，每60度测量一次该处内膜厚度，共6处，计算平均厚度。评估移植静脉内膜增生程度。
2.2.2 c-fos、c-myc免疫组化染色 石蜡标本作5μm血管横断面连续切片。应用c-fos及c-myc兔抗鼠多克隆抗体（工作浓度1：100），免疫组化染色采用SABC法染色、DAB显色。结果判定：在光学显微镜下观察，组织切片中显示胞核染为棕黄色或褐黄色者为阳性细胞标志。400倍光镜下随机计数5个视野内细胞总数中有多少是染色阳性细胞，以阳性细胞为分子计算c-fos蛋白表达指数，并用阳性率（％）表示。
2.2.3 Western blot 按参考文献［2］的方法操作，凝胶成像分析系统上摄像分析吸光度值。
2.3 统计学处理 每组数据以�x[TX-]±s�表示。所有数据在SPSS11.0下进行处理，差异显著性采用方差分析及q检验。P＜0.05有统计学意义。
3 实验结果
3.1 组织学染色结果 对照组移植后1天，可见内皮细胞脱落，管壁内有炎性细胞浸润。术后7天，可见新生内膜，VSMCs处于增殖和混乱状态。术后14天，移植血管出现显著增生的内膜，与术后7天相比差异显著（P＜0.05）。术后28天，血管内腔面基本完成内皮化，内膜增生更显著，与术后7天相比有显著性差异，内有大量VSMCs。M－Enk组内膜7天时较对照组减少了32％，14天减少了26％，28天减少了18％，与对照组相比，有显著性差异。NTX组内膜厚度与对照组相比7天增加了28％，14天增加了27％，28天增加了13％，与对照组相比，有显著性差异。
3.2 c-fos免疫组化染色结果 在光学显微镜下观察，c-fos基因蛋白定位于细胞核，组织切片中显示胞核为棕黄色或棕褐色为阳性细胞。对照组移植后1天，移植血管出现c-fos蛋白阳性表达达到高峰，阳性细胞百分比达11％，阳性细胞多靠近血管腔。移植后3天，c-fos表达有所下降，移植后1周，c-fos阳性细胞比例明显下降，与移植后1天相比，有显著性差异。M－Enk组移植1～3天，c-fos蛋白表达较对照组明显受到抑制，1天抑制率达35%,3天抑制率达38%，与对照组相比，有显著性差异；NTX组移植1～3天，c-fos蛋白表达较对照组明显升高，1天升高约47％，3天升高约58％，与对照组相比，有显著性差异。
3.3 c-myc免疫组化染色结果 对照组移植后1天，吻合口处少量c-myc蛋白阳性细胞出现，移植后3天，c-myc阳性SMC开始逐渐增多，移植后1周，c-myc阳性达高峰，与移植后1天相比有显著性差异；M－Enk组移植1～2周，c-myc蛋白表达较对照组明显受到抑制，1周抑制率达23%,2周抑制率达28%，与对照组相比，有显著性差异；NTX组移植3天～2周，c-myc蛋白表达较对照组明显升高，3天升高约24％，1周升高约23％，2周升高约30％，与对照组相比，有显著性差异。
3.4 Western blot结果 对照组c-fos表达在1天时达高峰。随时间推移逐渐下降，1周后逐渐恢复至正常水平，1天与1周相比差异有显著性（P＜0.05）。而c-myc表达在3天时开始逐渐升高，1周达高峰，2周后下降，1周与1天相比差异有显著性（P＜0.05）。
4 讨论
利用血管移植行各种旁路转流手术以改善肢体血供是血管外科治疗肢体缺血性疾病的常用术式和基本方法。可供选择的血管移植物首推自体静脉。然而，由于移植静脉内膜增生导致术后再狭窄，却成为远期疗效不佳的主要原因。当移植血管受到手术及压力变化等刺激后，发生多种生长因子及某些基因变化，通过复杂的细胞信息传递系统，使中膜SMC增殖迁移至内膜，并持续增殖导致血管内膜增生，从而引起移植血管狭窄［3］。目前，认为早期应答基因对细胞的增殖与分化起着重要作用［4］。由于早期应答基因的表达产物为DNA结合蛋白，他们可以进入细胞核内促进与SMC增殖相关基因的开放，产生大量生长因子样物质，从而刺激SMC增殖。
有文献报道［5］，内源性阿片肽受体系统对动脉损伤后的细胞复制调节产生抑制作用，其作用途径可能是通过阿片类物质－阿片受体结合后，激活细胞内信使传导（如Ca��2+�的蛋白酶被激活），从而抑制c-fos基因的表达。本实验应用内源性阿片类代表物质M－Enk，及其受体阻断剂NTX，观察M－Enk在静脉移植后对血管影响及作用途径。在实验中，观察到对照组静脉移植后c-fos蛋白在移植早期（移植后1～3天）即达高峰，而随时间推移，c-fos蛋白表达逐渐下降，2周后，无明显表达。目前研究认为［4］，当G0细胞受到生长因子或撕裂源诱导时，c-fos基因被激活，它是一种瞬间早反应基因，其与表达产物fun形成fos/fun二聚体，即具有较高活性的AP-1, AP-1通过顺势作用激活下游与细胞生长、分化及信号有关的基因，如c-myc基因，所以c-fos可能是一种核内“第三信使”分子，起着将细胞膜上传来的短效的细胞生长信息转化为细胞表型上的长效信息作用。故c-fos表达的增强与减弱，是细胞生长、增殖过程在基因水平的标志。
M－Enk是一种内源性阿片肽，广泛存在于血管内皮细胞，SMCs,及血管结缔组织。应用M－Enk在内皮剥脱的颈动脉球囊扩张模型中，DNA合成受到抑制［3］。而在本实验中，M－Enk组移植早期、中期，c-fos蛋白表达较对照组均明显受到抑制，与对照组有显著性差异表2。而同时期血管内膜SMC增生也受到明显抑制。证明在活体移植静脉模型，M－Enk有着同样对血管细胞复制的明显抑制。证明在活体移植静脉模型，M－Enk有着同样对血管细胞复制的抑制调节作用。这种作用已被证实作用位点在细胞周期中延长G�0/G�1期。在NTX组移植早期、中期，c-fos较对照组有更明显的表达，而1周以后无明显差别。同期各时段内膜均较对照组有明显增生（P＜0.05）。而NTX作为一种特异的长效阿片受体阻滞剂［5］，阻断了内源性阿片类与其受体的结合，其缩短了细胞周期的时间，即缩短了G0/G1期，从而增加了DNA合成，使细胞复制，但它并不改变细胞的生存时间。因为，内源性阿片类物质与其受体的结合后作用位点在G0/G1期，即细胞复制周期始动阶段，故推断其首先引起c-fos的表达。而本研究结果也显示M－Enk与内源性阿片肽受体结合后调节者c-fos的表达。
c-fos蛋白在移植早期（移植后1～3天）即达高峰，c-myc蛋白则在移植中期（移植后1周）达到高峰，提示两者表达的诱导途径也可能有所不同。Miano等［6］认为，c-fos表达主要由机械损伤引起，而c-myc表达主要与体液因素有关。二者的有序表达提示，c-fos基因表达可能是细胞生长的触发因素，它可进一步诱导c-myc的表达从而调控SMC增生，c-fos对SMC增殖的调控可能作用于转录水平，而c-myc可能作用于翻译水平。结合既往研究的结果［7-8］，移植后增殖细胞核抗原（PCNA）不同相的表达、内膜增厚的程度与c-myc蛋白表达的变化是一致的：即在移植后逐渐升高，在1周时达高峰，且与移植早期差异均有显著性，这一结果说明，c-myc蛋白可能参与了细胞的持续增殖。本实验中，M－Enk组移植3～7天，c-myc表达较对照组明显受到抑制（P＜0.05）；而NTX组同时期较对照组明显升高（P＜0.05）。推断这种作用与c-fos,c-myc的序贯表达有关。但其确切机制仍有待进一步研究证明。
当血管受到创伤，内源性阿片肽与其受体相互作用的自分泌环可能在一定程度上被破坏；而外源性阿片肽，可能在内源性阿片肽缺失的位点，其达到饱和后发挥作用。在受损内膜和中膜内，内源性和外源性阿片肽的活性效应，也会产生一种蓄积效应，这一点也已被证实［9］。本实验从一定程度上阐明了M－Enk与其受体轴在血管再生方面的重要性。这种自分泌环在血管修复过程中，对血管结构的调整产生了巨大作用。当血管受到创伤后，例如静脉移植于动脉，随着这种自分泌环的平衡的破坏，内源性阿片肽不再能够维持细胞复制中的平衡状态，故引起了移植静脉的血管内膜增生，从而引起了血管的血液流变学的改变。所以，在血管移植早期应用一定量的外源性阿片类物质，或者找到有效的阿片类受体激动剂，可能会对移植静脉后再狭窄，起到有效的预防作用。
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