【www.zhangdahai.com--地税国税公文写作】
【摘要】目的细粒棘球绦虫存在着实质性的基因遗传差异，将影响对治疗药物的敏感性，抗原变异也可影响对人体包虫病的准确监测以及免疫预防，因此对新疆细粒棘球绦虫基因多态性研究、分子生物学及血清学实验诊断方法研究与包虫病的流行防治直接相关。方法：本研究采用DNA测序法对细粒棘球绦虫mtDNACO1基因片段进行序列分析，明确检测到的细粒棘球绦虫的基因型及其株内遗传变异。结果通过对新疆塔城50例细粒棘球绦虫分离株标本(取自被感染羊)CO1基因序列分析，发现新疆塔城地区羊株主要流行株为Gl型，其中CO1基因片段长度为789bP，并发现一株新的基因型。结论将所检测到新疆细粒棘球绦虫基因单倍体序列与Genbank中己登录细粒棘球绦虫基因序列进行同源性比较分析，发现变异碱基对，证明新疆细粒棘球绦虫基因序列存在多态性。
【关键词】新疆塔城； 细粒棘球绦虫； 新G1基因型
包虫病是一种严重的人畜共患性疾病，呈世界性分布。我国西北广大农牧区是包虫病的主要流行区[1-2]， 以Eg所致囊型包虫病（CE）尤为多见，世界各地的细粒棘球绦虫具有基因多态性和致病的多样性[3]。 虫株基因型不同对人的感染力、抗原结构特点、对化疗的反应以及流行病学上的特征不同，而在基因水平上进行细粒棘球绦虫虫株基因型及其差异研究，对包虫病疫苗、诊断试剂及药物的研制和开发具有重要意义[4] 。
近年来， 已在基因水平上对细粒棘球绦虫流行病学、致病性、免疫学、遗传学方面的差异开展了广泛研究。Nakao M等[5] 认为细粒棘球绦虫从基因水平分析应重新分类，分为不同的种株，目前尚需进一步研究证实。新疆地区存在地理气候多样性和适合细粒棘球绦虫寄生的多种中间宿主， 如羊、牛、骆驼、猪、鹿、马、啮齿类野鼠和人等，并与多个国家和省、自治区接壤，细粒棘球蚴又有广泛的中间宿主适应性，在长期的进化演变过程中，寄生虫在与宿主之间的互相适应中发生着变异，株间发育差异将影响以杀成虫剂阻断传播计划的效果，抗原变异也可影响对人体包虫病的准确监测以及免疫预防。因此新疆各地区存在细粒棘球绦虫发生变异的多种因素，故细粒棘球绦虫也可能发生变异，存在新的虫株（基因型）或变异株，这对新疆细粒棘球绦虫虫株基因型的全面了解及多态性研究与包虫病的致病机制直接相关对包虫病疫苗、诊断试剂及药物的研制和开发具有重要意义[6] 。
本研究采用核酸序列分析对新疆的主要牧区塔城地区的来源于羊的细粒棘球绦虫的遗传物质进行研究，探讨不同分类水平上的细粒棘球绦虫种群之间的系统发育、进化机制和种群遗传变异及分化，从小范围地区上探寻细粒棘球绦虫各虫株之间的发育及变异关系。
1 材料与方法
1.1引物与主要试剂
引物由上海生工生物有限公司合成。（引物序列见表1） 组织DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖及其他生化试剂均购自上海生工生物有限公司。
表1PCR引物
Table 1 PCR primers ,annealing temperature and the length of products
1.2 棘球蚴囊标本来源
包囊标本均来自新疆塔城地区屠宰场无菌提取的包囊组织和原头节，用生理盐水漂洗5次，包囊组织保存在95%的酒精中、原头节沉淀备用。
1.3 细粒棘球绦虫DNA的提取无菌取感染羊的包囊组织约25mg放入培养皿中，1ｘTE漂洗两遍放入离心管中，严格按照DNA提取试剂盒操作，提取后用紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，-20℃保存备用
1.4 PCR扩增细粒棘球绦虫线粒体DNA以提取的细粒棘球绦虫DNA为模板，加特异性CO1引物，扩增细粒棘球绦虫CO1基因片段。扩增参数:94℃预变性30s;94℃变性30s;55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环:72℃延伸7min。每次反应均设不含DNA模板的阴性对照和己知细粒棘球绦虫DNA模板的阳性对照。
1.5 测序 将样品寄至北京天根生物科技有限公司测序。
1.6 PCR序列同源性分析
应用DNAman软件对所测得的新疆细粒棘球绦虫COI基因序列进行同源性分析。用Genbank/BLAST功能对序列进行生物信息学分析。应用CLUSTALW法和DNAman软件对所测新疆细粒棘球绦虫CO1基因序列进行同源性分析，以GenBank中细粒棘球绦虫的CO1基因序列AF297617(GI)、作为标准序列，统计新疆细粒棘球绦虫CO1基因序列变异位点数 。
2结果
2.1新疆细粒棘球绦虫PCR扩增结果
以细粒棘球绦虫DNA为模板，用CO1引物进行PCR扩增，可得到大小约873bp的扩增条带，产物的长度与引物设计的预期产物长度一致，且条带清晰，说明PCR产物可信，可用来测序，结果如图1―1。
图1-1细粒棘球绦虫C01基因PCR扩增产物
M：DNA标志物（DL-2000）
1：阳性对照
2：感染羊肝包虫内囊基因组PCR产物
2.2新疆细粒棘球绦虫分离株的基因型及序列分析
采用DNA测序法对新疆细粒棘球绦虫mtDNACO1基因片段进行序列分析，测定的CO1基因片段长度为789bp。通过对新疆50个细粒棘球绦虫分离株(来自感染羊)CO1基因序列分析，发现各序列间有差异，但均为Gl基因型。以GenBank中细粒棘球绦虫的CO1基因序列AF297617(G1)为标准序列作对比，同源性为99.2%-100%.
将所测的50个新疆细粒棘球绦虫Gl型基因单倍体与Genbank中Gl型基因单倍体AF297617进行同源性比较分析，其中1个Gl型基因单倍体序列变异与AF297617相同，其余序列分别与AF297617、AB271235、EF367277相比同源性为100%。发现15个新疆细粒棘球绦虫Gl基因单倍体序列变异在Genbank中有100%同源序列，但1个Gl型基因单倍体Genbank未找到相同变异序列，是新发现的细粒棘球绦虫基因序列。新发现的G1基因变异位点如下：
表1-4新疆细粒棘球绦虫G1型各分离株CO1基因核苷酸变异位点
3讨论
细粒棘球绦虫虫株的鉴别比较复杂，而DNA序列中有丰富的进化信息，不同的生物种类存在不同的DNA序列，且具稳定性，通过DNA序列分析可以研究生物的进化过程，确立物种间的进化关系，显示种间和种内的亲缘关系[7]。因此DNA序列分析是鉴定生物体不同种、亚种和地理株最直接的方法，还可避免生活史阶段的环境变异和宿主诱导的修饰及翻译后修饰的影响。线粒体DNA是原核生物和真核生物细胞内的重要细胞器，常作为重要的分子标志用于生物种群的遗传变异研究，尤其适于种下水平分类研究[8]。本研究观察了新疆伊犁地区绵羊细粒棘球绦虫CO1基因序列，发现在新疆塔城地区绵羊中主要存在 G1基因型， Gl型分离株序列同源性为99.2%-100%。发现15个新疆细粒棘球绦虫Gl基因单倍体序列变异在Genbank中有100%同源序列，但1个Gl型基因单倍体Genbank未找到相同变异序列，是新发现的细粒棘球绦虫基因序列。
本研究表明，新疆伊犁地区细粒棘球绦虫具有丰富的遗传多态性。在获得序列遗传数据的基础上，从分子水平较准确地反映新疆细粒棘球绦虫虫株之间的遗传差异，对掌握细粒棘球绦虫的分子生物学特征、寻找和追踪传染源、分析棘球绦虫进化史、确定棘球绦虫的致病性、指导临床治疗和制订包虫病防治措施具有重要意义[9]。
参考文献
[1]Romig T，Dinkel A，Mackenstedt U.The present situation of ec hinococcosis in Europe［J］.Parasitol Int，2006，55（Suppl）：187-191.
[2]柴君杰,焦伟,伊斯拉音等.新疆北部地区囊型包虫病的流行现状[J].热带病与寄生虫学,2004,2(3):139-143.
[3]吴继红.边疆地区包虫病的流行原因及防治对策[J].医学信息, 2007,.20(4):682-683.
[4]Ito A Introduction of ongoing research projects on echinococcosis at Asahikawa Medical College and some comments on the surveillance ，prevention and control of alveolar echinococcosis in Japan [J]. Hokkaido Igaku Zasshi ，2001 ，76 (1) :3-7.
[5]Nakao M， MCMANUSD P，SCHANTZPM， et al. A molecular phylogeny of the genus Echinococcus inferred from complete mitochondrial genomes. Parasitology，2007，134（Pt 5）:1- 10.
[6]Ito A Introduction of ongoing research projects on echinococcosis at Asahikawa Medical College and some comments on the surveillance ,prevention and control of alveolar echinococcosis in Japan [J]. Hokkaido Igaku Zasshi ,2001 ,76 (1) :3-7.
[7]马秀敏,刘春燕,岳进巧等.细粒棘球绦虫基因型的微卫星分析[J].中国人兽共患病学报,2009,25(9):846-848.
[8]Feagin，JE，Mitoehondr ialgenome diversity in Parasites[J] . Int J Parasitol，2000，30:371-390.
[9]余森海.棘球蚴病防治研究的国际现状和对我们的启示[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2008,26(4:241-244).
国家自然科学基金
（30960358, 30901374，81060135，30560146，30860263）; 新疆医科大学科研创新基金（2008－3）;国家教育部春晖计划（Z2004－2－65004）新疆医科大学大学生创新性实验计划项目（CX2009052）
通讯作者：丁剑冰
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
