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摘 要：目的：探讨三七总皂甙对局灶性脑缺血再灌注损伤的海马神经生长因子及酪氨酸激酶A含量变化的影响。方法：120只SD大鼠体重200~220g，随机分为3组：假手术组(n=40)，局灶脑缺血再灌注组(n=40)和三七总皂甙治疗组(n=40)。线栓法制备大脑中动脉梗阻（MCAO）模型，药物组在脑缺血再灌注即刻和12h腹腔注射三七总皂甙，模型组和假手术组均注射等量生理盐水。分别在缺血再灌注2h、4h、6h、12h和24h处死动物，运用RT―PCR技术检测缺血侧海马组织内NGF和TrkA的mRNA的表达变化。结果：再灌注损伤后，损伤侧海马组织内NGF和TrkA的mRNA表达均增高。在三七总皂甙治疗组中NGF和TrkA的mRNA于再灌注2h上升，4h达高峰。结论：脑缺血后损伤侧海马神经元内NGF和TrkA的mRNA含量增多，可能有利于受损神经元的修复。
关键词：局灶性脑缺血再灌注；三七总皂甙；神经生长因子；酪氨酸激酶A
中图分类号：R322.81文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）02-0026-03
现代药理研究证实三七皂苷对多种动物脑缺血及再灌注损伤有良好的保护作用，其作用机理与钙离子拮抗及抗自由基等作用有关，同时三七皂苷还具有降低血粘度、抑制血小板聚集、扩张血管、降低血脂、改善学习记忆功能及改善微循环和抗炎等作用［1，2］。
本研究拟用大鼠大脑中动脉线栓法建立缺血模型，采用RT-PCR技术，检测海马组织内NGF及TrkAmRNA含量的变化，并研究三七总皂甙对大鼠大脑中动脉栓塞后脑内NGF及TrkA含量变化的影响来阐明其对缺血性脑损伤的神经元保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料
成年SD大鼠，雌雄各半，体量220～250g，由昆明医学院实验动物中心提供。三七总皂甙注射液(批号：ZZ-5559，商品名：脑明注射液)。TRIZOL试剂（Molecular Research Center），逆转录试剂盒Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas Company)，PCR试剂盒PCR Master Mix Kit（Fermentas Company），DNA Ladder Marker 2000，DNA上样缓冲液(大连宝生物)，TRIZOL(Molecular Reseach Center)。兔抗NGF多克隆抗体(Chemicon)，兔抗TrkA多克隆抗体(博士德生物工程有限公司)， 二步法免疫组化检测试剂盒PV-9000(北京中杉)，浓缩型DAB试剂盒(北京中杉)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组
随机分成3组：假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、三七总皂甙治疗组(PNS组).每组根据再灌注时间不同再分为2h、4h、6h、12h和24h 5个亚组，每亚组8只动物。
1.2.2 模型制作
参考Longa［3］的线栓法，造成右侧大脑中动脉供血区的缺血；2h后拔出线栓恢复再灌注，并缝扎切口。假手术组仅分离血管而不插线栓。三七组在拔出线栓后立即经腹腔注射皂苷注射液(2mL ip)，随之每隔12h用药1次［5］。缺血再灌注组及假手术组注射相当剂量的生理盐水。
1.2.3 RT-PCR技术检测
实验动物在术后各时间点，活体取损伤侧脑皮质组织约100mg，TRIZOL试剂提取总RNA。取4μg的总RNA用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，操作按照试剂盒说明书进行，反应条件是94℃ 45s，退火温度见表1所示45s，72℃ 1min，各基因的引物序列、最佳退火温度及扩增产物大小如下表所示，引物由大连宝生物公司合成。PCR产物取20μL用含0.5μg/mL EB的1%琼脂糖凝胶电泳，BIO-RAD凝胶成像仪紫外模式下分析凝胶图片。
1.2.4 统计学处理
组内比较采用单因素方差分析；各组间的比较采用t检验。统计软件选用SPSS 11.5。
2 结果
2.1 NGF和TrkA在各组中mRNA的表达变化
2.1.1 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性
RNA样品1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳条带，可见28S、18S条带，说明所提取RNA样品完整，可以用于逆转录(图1)。
2.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的结果
在各组中均有β-actin、NGF和TrkA mRNA的表达，得到目的基因片段。1%琼脂糖凝胶电泳观察到特异性扩增条带，大小分别为227 bp、479bp和824bp，与预期的片段长度一致（见图2~4）。
图例说明：1：DL2000 DNA Marker；2：再灌组2h组；3：再灌组4h组；4：再灌组6h组；5：再灌组12h组；6：再灌组24h组
2.1.3 图片灰度扫描结果
对图片进行灰度扫描。以β-actin灰度值为参照，求得各组的NGF和TrkA与β-actin的相对比值。数据用均数±标准差(±s)表示（见表2）。结果显示：再灌注损伤后，海马组织内NGF和TrkA的mRNA表达均增高，与假手术组比较有统计学意义（P
