【www.zhangdahai.com--调研报告】
【摘要】 目的 实验性rG145R变异抗HBs多克隆抗体。方法 采用纯化全基因重组G145R变异HBsAg常规皮下免疫制备小鼠多克隆抗体，以间接ELISA、SDS-PAG及Western blot等多种实验对制备物进行鉴定，并初步应用于转染CHO细胞的化学染色。结果 制备物在Western blot、ELISA中和试验与抗原替代ELISA中与重组G145R变异HBsAg及重组野生HBsAg等均有很好的特异性与反应性；对此两种抗原的ELISA效价前者显著高于后者（分别为51200与6400）；将其用于2A8细胞(转染并分泌G145R HBsAg)爬片的PAP染色，亦取得较理想的实验结果。结论 采用重组G145R变异HBsAg免疫成功制备出较高效价的抗体。鉴于该抗体同时与野生重组wHBsAg存在较强交叉反应，其与野生抗HBs的混合应用能增ELISA免疫逃逸变异的检测能力。 �
【关键词】乙型肝炎病毒；基因变异；合成肽；多克隆抗体��
The preparation and identification of anti-HBV G145R HBsAg polyclonal antibody
LI Pei-shan，GONG Jing-song，LI Shi-jun，et al.
Biological Technology Group Corporation, Wuhan Institute of Biological Products，Hubei430060，China
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【Abstract】 Objective To prepate the mouse polyclonal Anti G145R rHBsAb and analyze its immunological characteristics． Methods The recombinant G145R mutant HBsAg were respectively used to develop poly-clonal antibodys through immunize BALB/c rats, and the polyclonal antibody were confirmed by empirical methods, include western blot, ELISA and SDS PAGE, and preliminary used in chemical staining for the CHO.Results The recombinant G145R mutant HbsAb poly were indentified by western blot and ELISA, it showed a good specific reaction performence to both of G145R rHBsAg and r-wHBsAg． And the potency of the reaction with G145R rHBsAg was obviously higher than r-wHBsAg(they were 51200 and 6400)．And it had a good result of the PAP staining of cell 2A8 also． ConclusionThe satisfactory antibody could be created by immunizing with G145R rHBsAg． Because of the cross reaction with r-wHBsAg, the recombinant G145R mutant HbsAb poly which is mixed with r-wHBsAg can enhance the detectivity of ELISA.�
【Key words】 Hepatitis B virus; Gene variation ;Synthetic peptide; Polyclonal antibody
HBV具有较高的变异趋势，发生在S蛋白“a”决定簇基因区段的突变可能导致其HBsAg抗原性改变而形成免疫逃逸株（immune escape mutant strain, IEMS）[1]。由S基因第nt 587位G-A突变所产生G145R变异株（G145R IEMS）是其中发生频率最高，抗原性飘逸最彻底的IEMS之一[1～4]。受实验材料限制，对该变异的研究仅限于其变异机制及其分子流行病学调查。为进一步拓展对其基础与临床研究范围，笔者进行抗重组G145R变异S蛋白多克隆抗体（抗rG145R HBs poly）的制备研究，现报道如下。�
1 材料与方法�
1．1 实验材料 重组G145R变异S蛋白（r-G145R-HBsAg）由同济医院医学实验中心采用亲和层析法制备[3]；HBsAg “a”决定簇合成多肽（G145R-SP24，包含123～147位氨基酸）、腺病毒抗原初提物（ADV-Ag）、2A8细胞爬片以及PAP染色试剂等由同济医院医学实验中心提供；HRP标记羊抗鼠IgG（GAM-HRP）购自Sigma公司。抗HBs A11 McAb，野生重组全基因HBsAg（r-wHBsAg，CHO细胞分泌）及其狂犬疫苗前体等由本所制备。完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）为Gibico公司产品；CNBr-activated Sepharose 4B为Amersham Pharmacia Biotech 公司产品。BALB/c小鼠（8周龄，雌性）由湖北省疾病预防与控制中心动物室供应。�
1．2 实验方法�
1．2．1 动物免疫 取纯化r-G145R-HBsAg（50 μg/ml）适量，加等体积福氏完全佐剂，乳化后于5只BALB/c小鼠背部皮下多点注射，每只小鼠每次注射0．2 ml（5．0 μg）。2周后取同上r-G145R-HBsAg，加等体积福氏不完全佐剂乳化，背部皮下多点注射；间隔2周同上以做加强免疫共3次。末次免疫后10 d试血及采血，分离血清置-20℃冻存。另取5只BALB/c小鼠同上法进行r-wHBsAg免疫。�
1．2．2 抗体鉴定 抗rG145R HBs效价检测采用间接ELISA，中和试验及其包被抗原取代试验在间接ELISA的基础上进行。具体操作参照文献及本室既往报道[3]：抗体纯度鉴定采用weistern blot，操作参照文献[3]；PAP细胞组化染色根据既往报道方法[3]。�
2 结果�
2．1 动物免疫结果 以rG145R-HBsAg及r-wtHBsAg两者分别免疫（共4次）实验动物。末次免疫后10 d自眼眶采血，分离血清置-20℃冻存。将所采集血清按组等体积混合，采用间接ELISA进行效价检测，结果见表1。�
2．2 抗rG145R HBs（poly）的特异性鉴定�
2．2．1 抗原取代实验 以rG145R-HBsAg、r-wtHBsAg、G145R-SP24、ADV及狂犬疫苗前体等为抗原（10 μg/ml）包被反应板，分别与抗rG145R HBs poly及抗r-wHBs Poly作间接ELISA，比较该抗体其与不同抗原的反应性，实验结果见图1。�
2．2．2 中和实验 同上以G145R rHBsAg包被反应板，待测标本（抗G145R rHBs）稀释至适当浓度,先与等体积不同浓度抗原反应30 min，然后同上做间接ELISA，每一浓度中和抗原重复3孔，比色并计算各组反应孔OD均值。实验结果见表2。两种抗原均能获得阳性中和结果，其中rG145R HBsAg的中和能力显著强于r-wHBsAg。�
2．3 Western blot鉴定 取G145R rHBsAg适量，经SDS-PAGE分离后，分别做考马斯亮兰R-250染色及其Western Blot分析，并以自然表达HBsAg及r-wHBsAg做对照。实验结果见图2。三者在SDS-PAGE染色强度相似，Western blot分析（待测抗体1/100稀释）结果显示三者的染色强度未见明显差别。
注：M:蛋白Marker;1~3:自然表达HBsAg、r-wHBsAg 及r-G145R HBsAg SDS-PAGE结果； 4~6：同法电泳分离, 抗G145R HBs（Poly） Western Blot分析之HBsAg、r-wHBsAg及rG145R-HBsAg结果
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2．4细胞免疫组化染色以抗rG145R HBs（1/100稀释）为一抗，对G145R变异全基因转染2A8细胞爬片进行PAP染色。实验结果见图3。�
3 讨论 �
HBV IEMS临床感染率的迅速上升日益为世界各国医疗行政部门与各相关学科所瞩目。对该类变异感染诊断及预防方法的研究已经成为国内外众多学者关注的焦点[4，5]。现有研究表明，HBV S蛋白中“a”决定簇主要包括两个借二硫键相连而形成的环状结构，独特的空间构象赋予该部位极强的免疫原性，是刺激机体产生保护性抗体的最主要抗原位点。发生在此区段（即123～147位氨基酸）及其附近的单点（或多点复合）替代突变能导致HBsAg分子局部空间结构发生显著改变，从而引发“A”决定簇及其附近位点的抗原性发生显著漂移。然而这种漂移具有很大的多态性与不完全性，不同来源抗体（或单克隆抗体）对这些变异产物的识别能力通常存在较大的差别[6] 。深入探讨抗原性漂移的内在规律有可能为IEMS感染预防及其临床诊断技术的研究发掘到新的方向。�
为进一步开展HBV IEMS感染的基础，临床及流行病学研究，笔者在既往工作的基础上进行小鼠多克隆抗G145R HBsAg(抗rG145R HBs poly)的制备。结果显示制备物在SDS PAGE分析中显示与其他野生抗原相同的两条区带（分别约为23、27 Kd），该抗体在Western blot分析中对r-G145R-HBsAg的染色强度与对r-wHBsAg大致相当；采用相同的免疫流程，所制备的抗rG145R HBs poly对rG145R HBsAg的效价较其对rG145R HBsAg的效价相近（或略低）；抗r-wHBs poly对前者的效价则显著低于后者；此两种抗体对r-wHBsAg的反应性前者亦低于后者。这些结果提示：①这两种重组蛋白的一级结构及其某些生化行为大致相同；②两者分子表面仍旧存在较多较强的共有抗原决定簇；③尽管发生了替代变异，但产生显著抗原性漂移后的“a”决定簇及其相关部位仍旧是变异蛋白分之上的主要决定簇之一[7]；④抗rG145R HBs poly效价相对较低可能与其变异多肽（rG145R HBsAg）的稳定性较差有较大关联[3]；上述研究结果同时还表明采用rG145R HBsAg免疫制备的抗rG145R HBs poly显然不能用于对单一rG145R HBV感染的临床诊断。然而此抗体对rG145R HBsAg的反应性显著的高于采用r-wHBsAg制备的多克隆抗体，但与后者的结合特征与rG145R HBsAg基本相同。此外，新近研究还显示，即便是采用抗r-G145R HBs mAb，在ELISA检测中亦与wtHBsAg具有一定的交叉反应，其对部分IEMS表达产物的结合能力明显高于对wtHBsAg甚至rG145R HBsAg自身[3]。鉴于既往采用野生抗HBs制备的ELISA试剂虽能进行HBV HBsAg检测，但其检测效果显然不尽人意[8]，笔者设想利用本研究抗rG145R HBs poly与野生及多种其他IEM 变异HBsAg存在明显交叉反应的特点，将其与抗wtHBs（poly）一道用于对血清HBsAg ELISA检测。有理由相信这两种抗体的有机组合将是提高现有ELISA试剂IEMS临床检测能力的有效途径。�
参考文献
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