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[摘要] 目的：优选白花蛇舌草总黄酮超声提取最佳工艺。方法：选择无毒的有机溶剂乙醇作为提取溶剂，超声波作为提取方法，然后用聚酰胺色谱柱纯化总黄酮成分，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法，以芦丁为对照品计算总黄酮的含量，并用正交设计法进行提取工艺优化。通过考察不同因素和水平对提取效率的影响，优选出白花蛇舌草中总黄酮的最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺是先用石油醚脱脂1次，提取溶剂为70%乙醇，料液比为1:20，超声时间为30 min，提取次数为3次，提取率为2.375 6%。结论：优选出的工艺简单易行，能保证白花蛇舌草中总黄酮提取完全。
[关键词] 白花蛇舌草；总黄酮；正交试验；超声波提取；紫外分光光度法
[中图分类号] R943[文献标识码] C[文章编号] 1674-4721（2011）08（b）-144-03
Study on the ultrasonic extraction technique of the total favonoids from hedyotis diffusa wild
HUNAG Hui1, TIAN Suying2*
1.Department of Pharmacy, the Chinese Medicine Hospital of Huizhou City, Guangdong Province, Huizhou 516001, China; 2.Laboratory Center of Zhongshan College, Guangdong Pharmaceutcal University, Zhongshan 528458, China
[Abstract] Objective: To establish the best ultrasonic extraction technique of the total favonoids from hedyotis diffusa. Methods: Chose non-toxic organic solvents ethanol as solvent extraction, used ultrasonic extraction as method, and then used as polyamide chromatography column purification flavonoid, using NaNO2-Al(NO3)3-NaOH show color method, rutin ethanol-water calculation, the content of flavonoids with orthogonal design method for the extraction process optimization. By investigating the different factors and level on the influence of the optimum extraction efficiency, the white snake tongue grass of the best extraction technology of flavonoids. Results: The best condition was as follows: degreasing with petroleum ether fot two times, then add 20 times volume of 70% alcohol, ultrasonic extract for 30 min with 3 times. The extration yield was 2.375 6%. Conclusion: The extraction method is appropriate, simple and feasible. It is an ideal way to extract the flavonoids of hedyotis diffusa.
[Key words] Hedyotis diffusa; Total flavonoids; Orthogonal experiment; Ultrasonic extraction;Ultraviolet spectrophotometry
白花蛇舌草（hedyotis diffusa）为茜草科一年生草本植物白花蛇舌草的全草，具有清热解毒、利尿消肿之功效，是民间常用的中草药[1]。现代药理研究表明，其含有的总黄酮具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、增强免疫力等作用，是一类极具开发价值的天然活性物质[2~8]。正交设计法（orthogonal design）是一种研究与处理多因素实验的重要数理统计方法，可以尽可能少的试验次数，获得最满意的试验结果。因此，本实验采用正交设计法，通过考察不同因素、不同水平对总黄酮提取率的影响，优选出白花蛇舌草总黄酮的最佳提取工艺。
1 仪器与试药
Aglient 8453紫外-可见分光光度计；BP211D Sartorius型分析天平（德国赛多利斯）；XT220A Precisa 型分析天平（瑞士普利赛斯）；DFY-200型粉碎机（浙江温岭市大德中药机械有限公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（上海浦东物理光学仪器厂）；KQ-500型超声波清洗器（40 kHz；500 W；江苏省昆山市超声仪器有限公司）。
白花蛇舌草（购自广州致信中药饮片有限公司），经广东药学院田素英副教授鉴定为茜草科一年生草本植物白花蛇舌草Oldenlandia diffusa （Wild.） Roxb.的干燥全草；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707）；聚酰胺（柱层析用，60～80目，浙江台州市路桥四甲生化塑料厂）；水为蒸馏水，无水乙醇，石油醚，氢氧化钠，结晶氯化铝，亚硝酸钠均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
取芦丁对照品适量，精密称定，用50%乙醇溶液配制成浓度为0.101 6 mg/ml的对照品储备液。
2.2 供试品溶液的制备
取白花蛇舌草粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入石油醚50 ml，超声提取30 min，弃去石油醚液，滤渣挥干，重复此操作1次。按不同条件加入相应溶剂，进行超声提取。每次提取结束后，提取液用纱布滤过，滤渣至水浴上挥干，再按要求加入溶剂继续提取。合并滤液，滤液分次倒入蒸发皿中，80℃浓缩至10 ml左右，加入0.4 g聚酰胺粉末搅拌蒸干。干法上样（内径1.0 cm，长20 cm，未扮药的聚酰胺粉末1.1 g），用蒸馏水淋洗至洗脱液无颜色，弃去洗脱液。用70%乙醇洗脱，自黄色色带流出时开始收集洗脱液，至50 ml量瓶中，并用70%乙醇定容，摇匀。
2.3 测定方法的建立
2.3.1 溶液的显色精密移取适量样品溶液至10 ml具塞刻度试管中，用50%乙醇稀释至5 ml，加10%亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，静置5 min。加5%硝酸铝0.3 ml，摇匀，静置6 min。再加入1.0 mol/L 氢氧化钠溶液2 ml，用50%乙醇补足至10 ml，摇匀，静置15 min，即可。
2.3.2 测定波长的选择取一定量供试品溶液和芦丁对照品溶液，按“2.3.1”项下的方法进行显色，以50%乙醇做空白试剂，平行操作，在400～600 nm波长范围内进行紫外扫描。图谱如图1所示，二者的最大吸收波长均在505 nm处。因此，选择505 nm作为测定波长。
2.3.3 标准曲线的绘制分别精密吸取对照品储备液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0 ml，置于10 ml具塞刻度试管中，按“2.3.1”项下方法显色，用对照品储备液为0.0 ml的试管做空白对照，于505 nm处测定吸光度。以芦丁对照品溶液浓度c（mg/ml）为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得回归方程：y=11.728x-0.008 5（r=0.999 4）。结果表明，芦丁在0.010 16～0.061 00 mg/ml浓度范围内与吸光度呈现良好线性关系。
2.3.4 精密度试验取2 ml同一浓度芦丁对照品溶液（0.101 6 mg/ml），按“2.4“项下方法操作，测定吸光度，连续测定5次。测得吸光度值的RSD为0.37%（n=5），结果表明，仪器精密度良好。
2.3.5 稳定性试验取同一份供试品溶液，按“2.4”项下方法操作，分别在0、15、20、25、30、35 min和40 min测定吸光度A，结果吸光度值的RSD为1.79%，表明供试品溶液在40 min内稳定性良好。
2.3.6 加样回收率试验取5份已知总黄酮含量的白花蛇舌草粉末约0.5 g，精密称定，分别精密加入芦丁对照品11.76 mg（即将芦丁对照品配制成0.588 0 mg/ml的溶液，每个试验号精密加入对照品溶液20 ml，挥去溶剂后再加入样品进行提取），按供试品的制备方法操作，计算加样回收率。结果平均回收率为96.69%，RSD为1.34%，n=5。结果见表1。
2.4 样品的含量测定
精密移取1 ml供试品溶液至10 ml具塞刻度试管中，按“2.3.1”项下方法显色并进行紫外测定，将吸光度代入回归方程计算总黄酮的含量，并计算出提取率。
总黄酮提取率（%）=（y+0.0085）×10×100/（11.728×1 000×w）×100。
式中：y为吸光度，w为白花蛇舌草粉末的取样量。
2.5 乙醇浓度的考察
1.0 g白花蛇舌草粉末经过石油醚脱脂2次，选择料液比为1:20，提取时间为20 min，提取次数为2次的条件下，以乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%进行超声提取，结果见图2。在体积分数为70%时，提取率达到峰值，故选择溶剂体积分数在60%～80%较为合适。
2.6 正交试验
以乙醇浓度（A），料液比（B），超声时间（C），提取次数（D）为4个因素，每个因素选用3个水平，用L9（34）正交表进行试验，每个试验重复进行2次。因素水平见表2，正交试验结果见表3、4。
表4方差分析结果表明，各因素对试验结果均有显著性影响，影响大小顺序为D＞A＞C＞B。由表3中极差R可知，最佳组合为A2B2C2D3，即乙醇浓度为70%，料液比为1:20，提取时间为30 min，提取次数为3次时总黄酮的提取率最高。
2.7 最佳提取工艺条件的验证
取供试品5份，每份约1.0 g，精密称定。用石油醚脱脂2次后，按最优条件A2B2C2D3平行操作，按“2.4”项下方法测定吸光度，根据标准曲线方程进行计算，测得总黄酮的平均含量为2.375 6%，RSD为1.29%。结果见表5。
3 讨论与结论
若采用将提取液直接浓缩蒸干，然后加水溶解上柱，发现会有部分脂溶性黄酮析出，使检测结果明显偏低。故将0.4 g聚酰胺粉末加入提取液中搅拌蒸干，使总黄酮充分吸附在聚酰胺粉末上，然后再采用干法上柱进行净化洗脱操作[9]。白花蛇舌草含有较多的叶绿素，直接提取会干扰紫外分光光度法的测定结果。提取前先用石油醚超声2次，可以去除大部分的叶绿素，而且可以提高总黄酮的提取率[10]。稳定性试验中，每隔5 min测定了样品的吸收度，结果40 min时其吸收度降为0.447 0，并且溶液颜色已开始变浅，RSD为1.79%。考虑到对测定结果准确性的影响，故应在显色后40 min内测定。而15 min时其吸收度最大，故选择在显色15 min后进行测定。由于时间限制，正交试验里的因素水平表，除了因素A（乙醇浓度）是通过单因素考察确定水平参数范围外，B（料液比）、C（提取时间）、D（提取次数）均是通过参考相关文献制定的。在今后的工作中，可分别对各因素进行单因素考察，进一步优化实验结果。
本实验通过正交试验研究了乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数对提取白花蛇舌草总黄酮效果的影响。结果表明，最佳提取条件是：石油醚脱脂2次后，采用70%乙醇，料液比为1:20，超声时间30 min，提取3次，其中提取次数对提取过程影响最大。该最佳工艺条件下，白花蛇舌草总黄酮的提取率为2.375 6%。超声提取法操作简单、快捷，能实现常温提取，可应用于白花蛇舌草总黄酮的提取。随着临床研究的进一步发展，白花蛇舌草总黄酮的药理作用及作用机制，将进一步被阐释。因而对白花蛇舌草总黄酮进行深度开发，研制新的制剂，寻找新的适应证，将会进一步满足临床需求，产生更大的社会与经济效
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（收稿日期：2011-07-06）
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