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【摘要】 为了确定Ets家族转录因子Elk1在睾丸组织中有无表达，提取了正常小鼠睾丸组织的总RNA，经RT-PCR、序列测定证实Elk1在正常小鼠睾丸组织中有表达，为进一步探讨其与睾丸发育及精子发生的关系奠定了基础。
【关键词】 Elk1转录因子；睾丸；小鼠
精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)微环境的转录调控需Ets相关分子(Ets related molecule, ERM)参与［1, 2］。ERM是Ets转录因子家族的成员之一，该家族至少包括11个亚家族、26个因子，广泛参与多种细胞的发育、分化、生长、转化等过程［3］。目前还不知道该家族其他分子在睾丸组织中是否表达。本研究旨在通过RT-PCR获得该家族转录因子Elk1基因的部分编码区，并对其序列进行分析，以确定其在正常睾丸组织中有无表达，为进一步探讨其与睾丸发育及精子发生的关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、材料
7~8 周龄、体重30~35 g的成年雄性昆明白小鼠4只，颈椎脱臼法处死后取睾丸放入液氮，后移入-70°C冰箱保存。大肠杆菌DH5α株为本室保存，克隆载体pMD18-T、Ex Taq DNA 聚合酶、dNTP、反转录酶、RNase、Olig-dT、RNase抑制剂均购自于Takara。DL2000、质粒提取试剂盒、DNA片段凝胶回收试剂盒均购自于北京Tiangen。Trizol试剂购自Invitrogen，焦磷酸二乙酯(DEPC)、琼脂糖均购自Sigma，其他常用试剂购自于长春宝泰克。
1.2 引物设计［4, 5］
根据GenBank发表的Elk1的全序列设计合成特异性引物。Elk1的上、下游引物分别为：5�-CCTGAACTCTCCAGTTAGCC-3�，5�-CG TCTCCTACTTCAATGGTG-3�扩增片段大小为191bp。
1.3 睾丸组织总RNA的提取及RT-PCR［4, 5］
参照试剂盒说明，采用Trizol一步法提取睾丸组织总RNA，电泳检测其完整性。采用常规方法进行反转录PCR反应，反应条件为： 94°C预变性5 min，94°C变性30 s，退火30 s(Elk1的退火温度分别为58.2)，72°C延伸1 min，72°C扩增10 min，循环数均为35个。用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，在紫外灯下观察结果并拍照。采用DNA片段凝胶回收试剂盒按说明回收PCR产物。
1.5 克隆载体构建及测序［4, 5］
将PCR产物与pMD18-T 载体4℃下连接过夜，构建重组质粒pMD-Elk1，经转化、筛选、质粒提取、PCR鉴定后，将阳性菌液制成甘油菌，送北京英俊公司测序。
2 结果
2.1 睾丸组织总RNA提取及Elk1的PCR扩增
将提取的总RNA凝胶电泳后在紫外灯下观察，可以见到2条清晰的电泳条带，分别为28S和18S，说明RNA提取成功，无降解。 Elk1的RT-PCR扩增产物凝胶电泳后在紫外灯下观察到一条大小在100-250bp间的清晰条带，与预期目的带大小191bp相符。
2.3 Elk1的序列测定
测序结果显示，所获Elk1 cDNA完全正确。表明本实验正确克隆了Elk1基因，与预期结果相符。
3 讨论
Trizol一步法提取RNA避免了传统提取方法的繁琐过程和质量不理想等问题。为获得高质量的RNA，提取中所有用具均需RNA酶抑制剂DEPC处理，玻璃器皿180℃干烤8 h以上，提取前无菌操作间紫外照射2 h以上。操作中经常更换手套，防止皮肤上带有的RNA酶降解组织中的RNA。此外，还要注意内源性RNA酶所造成的RNA降解。处死小鼠后应迅速取睾丸并立即放入液氮。为保证RNA的提取率，同时也有利于下一步的RNA纯化，取材量要大。加入Trizol后的反应时间适当延长，从而保证组织充分裂解。加大氯仿用量和延长反应时间，离心后只取上层清液，这样从睾丸组织中提取的总RNA回收率很高，质量也较为理想。有了高质量的总RNA，采用常规RT-PCR即可获得目的基因cDNA，从电泳结果及序列分析结果看，所获片段大小及核酸序列与预期完全一致。本结果为下一步利用荧光定量PCR、原位杂交等方法深入分析Elk1的表达量及准确部位，揭示其与睾丸发育、精子发生等的关系奠定了基础。
参 考 文 献
［1］ Chen C, Ouyang W, Grigura V, Hassell JA, Chandrashekar V, Hofmann MC, et al. ERM is required for transcriptional control of the spermatogonial stem cell niche. Nature, 2005,436: 1030-1034.
［2］ Schlesser HN, Simon L, Hofmann MC, Murphy KM, Murphy T, Hess RA, et al. Effects of PEA3 (ets variant gene 5) on testis and body growth, time course of spermatogonial stem cell loss, and fertility in mice. Biol Reprod, 2008,78: 483-489.
［3］ Gutierrez-Hartmann A, Duval DL, Bradford AP. ETS transcription factors in endocrine Systems. Trends Endocrinol Metab, 2007, 18 (4): 150-158.
［4］ F 奥斯伯，R 布伦特，RE 金斯顿，等. 精编分子生物学实验指南. 严子颖，王海林，译. 北京：科学出版社，1998.
［5］ J 萨姆布鲁克，E F 弗里奇，T 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 第二版. 金冬雁，黎孟枫，译. 北京：科学出版社，1995.
