【www.zhangdahai.com--领导讲话稿】
【摘要】目的 构建含有人白介素24（hIL-24）基因的重组腺病毒载体，为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究奠定实验基础。方法采用基因工程技术将hIL-24基因的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,鉴定正确后在PAdEasy系统中进行细菌内同源重组，通过脂质体将正确重组体包裹并转染293A细胞以包装并扩增病毒。采用酶切及PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果酶切和PCR结果证实hIL-24基因重组腺病毒载体构建成功并可在293A细胞中表达，病毒滴度达107pfu/ml。结论 成功构建了有较强感染能力的含hIL-24基因的重组腺病毒载体。
【关键词】hIL-24；腺病毒；病理性瘢痕
The construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector of hIL-24LIANG Jie, HE Hai-tian PENG Zhi, et al. Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, Guangdong Province China
【Abstract】ObjectiveTo construct and identify the recombinant adenovirus vector of human IL-24 gene for future gene therapy of pathological scar tissue. MethodsThe human IL-24 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrack-CMV to form the transfer vector by the method of homogenous recombination in bacteria of PAdEasy system. Then the right recombinant adenovirus was transfected into 293A cells using Lipofectine 2000. The recombinant adenovirus vector was identified by restriction enzyme digestion and polymerase chain reaction (PCR). ResultsRestriction endonuclease and PCR analysis confirmed that the human IL-24 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was 107pfu/ml. ConclusionThe recombinant adenovirus vector of hIL-24 was successfully constructed with highly infection.
【Key words】Human IL-24 gene; Adenovirus; Pathological scar
人白介素24基因（hIL-24）是一种肿瘤抑制基因，通过多种途径抑制、诱导、细胞的生长，对肿瘤细胞有选择性杀伤作用而对正常组织几乎无毒副作用，并且具有调节免疫系统的功能，是当今人们研究的热点[1]。目前已经在多种肿瘤如前列腺癌、肺癌等的肿瘤基因治疗方面取得实验成功[2]。近年来许多研究表明病理性瘢痕的形成与细胞周期蛋白、细胞因子、癌基因等密切相关。然而hIL-24基因与病理性瘢痕的关系尚未见报道。我们过往的研究表明hIL-24基因在增生性瘢痕内的表达水平与正常皮肤组、普通瘢痕组的相比较明显降低，提示hIL-24基因在增生性瘢痕的形成过程中起着重要作用，可能与IL-24基因在组织中的表达低下有关[3]。本实验拟构建含有hIL-24基因的重组腺病毒载体，为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究做基础。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1试剂：PmeI、PacI、BglⅡ及XhoI购自NEB公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Omega公司；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒及PCR产物回收试剂盒购自Takara公司；DMEM培养基及胎牛血清购自Hyclone公司；Trizol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。
1.1.2菌株、质粒和细胞株：pAdtrack-CMV、AdEasy-1及菌种BJ5183（AdEasier-1细菌）购自Stratrgene公司；DH5a、293A细胞由本研究所保存。
1.2方法主要参照文献[4-5]操作。
1.2.1目的基因的获取采用Trizol总RNA提取试剂盒，按照试剂盒附带的说明书进行皮肤成纤维细胞总RNA提取并测定大部分样本OD260/OD280比值约等于2.0。应用TaKaRa公司的RT-PCR试剂盒进行IL-24基因片断的扩增。参照GenBank中IL-24基因序列，设计一对引物，根据克隆所需，在每条引物的5"端引入BglⅡ及XhoI的限制性酶切位点及保护性碱基，引物序列如下(下划线为限制性内切酶位点)：上游5′-CAGATCTGGTGGATTAAAGTGCCCAGC-3′，下游5′-CCTCGAGGGTCACCATCAGCAAGGTCAG-3′。反应体系：95℃预变性3min，再95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸4min(共30个循环)，72℃继续延伸12 min。
PCR反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳后应用Omega公司的PCR产物纯化试剂盒进行目的基因回收纯化。
1.2.2穿梭质粒pAdtrack-CMV/IL-24的构建将回收纯化的PCR产物和pAdTrack-CMV均以BglⅡ及XhoI充分双酶切后，在16℃条件下，应用T4连接酶连接IL-24片段及线性化的pAdtrack-CMV，4h后回收纯化，氯化钙法转化DH5a感受态细菌，在含有卡那霉素抗性的LB平板上培养过夜，挑取阳性克隆扩增培养，小量快速提取质粒后，经PCR及双酶切鉴定正确后，送Takara公司测序分析。
1.2.3腺病毒质粒的同源重组用PmeI酶切连接正确的pAdTrack-IL-24过夜，充分线性化后氯化钙法转入含有质粒AdEasy-1的BJ5183感受态细菌（AdEasier-1细菌）进行同源重组，重组后的重组体命名为AdEasy-IL-24。在含有卡那霉素抗性的LB平板上培养过夜，挑取平板上较小的菌落，碱变性法小量快速提取质粒，经PacI酶切后电泳筛选鉴定AdEasy-1-IL-24重组体后，大量抽提重组腺病毒载体质粒AdEasy-IL-24备用。
1.2.4重组腺病毒AdIL-24的包装、扩增PacI充分线性化AdEasy-IL-24后，按照Lipofectamine 2000操作说明将线性化的AdEasy-IL-24加入脂质体稀释液中轻轻混合，室温下静置20 min使其充分结合形成复合物。将混合物加入已达7O％～8O％贴壁融合的293A细胞中，轻轻混合。继续培养48 h后更换培养基，不同时间段观察细胞形态变化及荧光出现情况。7天后8O％左右细胞出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，收集细胞后分别-80℃，37℃中反复冻融3次裂解后离心，收集病毒上清，继续感染293A细胞以扩增病毒，重复扩增3轮。
1.2.5重组腺病毒AdIL-24转染293A细胞后RT-PCR鉴定取感染腺病毒2 d后的293A细胞，离心收集细胞，PBS洗涤3次后按试剂盒说明提取细胞的总RNA，经逆转录为cDNA，分别以上游5′-CAGATCTGGTGGATTAAAGTGCCCAGC-3′，下游5′-CCTCGAGGGTCACCATCAGCAAGGTCAG-3′作为IL-24的上下游引物，进行PCR反应。以GAPDH作为内参照，上游5′-CCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游5′-CCTGCTTCACCACCTTCT-3′，扩增长度为577bp。反应条件：95℃预变性3min，再95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸4 min(共30个循环)，72℃继续延伸12 min。同时取未转染重组腺病毒的293A细胞作为对照。
1.2.6 重组腺病毒AdIL-24的纯化及病毒滴度测定将生长状况良好的293A细胞，用胰酶消化后，细胞计数，稀释细胞浓度约为105个/ml后，在96孔板上按每孔100ul接种细胞，培养24 h后，将收获的重组病毒子按10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释后，每个稀释度按每孔100 μl接种1排，培养18 h后，荧光显微镜下进行荧光计数。按病毒效价(pfu/ml)＝(荧光数×10)/稀释度计算病毒效价。
1.2.7采用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdIL-24。收集的病毒以0.22 μm滤膜过滤后分装，-8O℃保存。
2结果
2.1PCR反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳显示扩增片断约为620bp（见图1），与目的片断大小基本符合，无非特异性扩增。
2.2 腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-24的构建和鉴定提取质粒，并经BglⅡ及XhoI双酶切后得到约9kb（质粒骨架）和620bp（IL-24基因）2个片段（见图2），和预期结果一致，表明构建成功。测序结果表明克隆得到的序列与GenBank中IL-24序列一致。
2.3腺病毒质粒的同源重组及鉴定将pAdTrack-CMV-IL-24经PmeI线性化后，氯化钙法转入含有腺病毒基因组质粒AdEasy-1的BJ5183感受态细菌，进行同源重组。筛选阳性克隆，小量抽提质粒DNA，经PacI酶切后电泳，可见约4.5kb和30kb左右的电泳带各一条，证明同源重组成功。
2.4重组腺病毒AdIL-24感染293A细胞的鉴定将鉴定正确的重组AdEasy-1-IL-24经质脂体转染293A细胞后2 d开始出现绿色荧光蛋白(GFP)表达（见图3），荧光表达随时间增强。
2.5293A细胞的形态学改变AdIL-24转染293A细胞5 d后，光镜下开始见空斑形成。293A细胞肿胀、变圆、脱壁，细胞核变大等典型的细胞病变效应。
2.6RT-PCR鉴定hIL-24在转染后的293A细胞中的表达AdIL-24重组腺病毒感染的293A细胞48h后，收集细胞抽提总RNA进行RT-PCR检测，结果显示一条620bp的条带，而对照组293A细胞中无相应条带，表明IL-24重组腺病毒构建成功，并且可以感染293A细胞。
2.7重组腺病毒滴度测定将细胞悬液后滴加于计数板上，置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。用GFP阳性计数法公式计算病毒滴度为107pfu/ml。
3讨论
重组腺病毒载体是目前应用最广泛的生物病毒载体之一，与其他病毒载体系统比较，具有明显优点：能将外源基因高效导入哺乳动物细胞；其转染不依赖细胞分裂，既可转染分裂期细胞，又可转染非分裂期细胞；携带的外源基因不与宿主基因整合，对人致病性低。上述优点使其成为一种高效而安全的基因转移工具，广泛应用于基因治疗的研究。腺病毒载体构建方法主要有细胞内同源重组法和细菌内同源重组法两种。本实验采用目前常用的腺病毒载体的包装方法：改良AdEasy系统，即将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的细菌重组，获得重组腺病毒载体基因组的质粒，再转染至293A细胞中包装成重组病毒颗粒。pAdEasy系统是一种高效的细菌内同源重组载体系统，与传统的重组腺病毒载体相比克服了周期长、步骤繁杂、效率低等不足，不需进行真核细胞内同源重组和噬斑筛选，使操作过程大大简化。
IL-24基因最初被命名为黑色素瘤分化相关基因7 (melanoma differentiation-associated gene, MDA-7)，是Jiang等在1995年应用干扰素β(IFN-β)和紫花欧瑞香素(MEZ)处理黑色素瘤细胞发现的。后来的研究表明IL-24对肿瘤细胞有选择性杀伤作用而对正常组织几乎无毒副作用，这与目前诸多非选择性杀伤或具有其他毒副作用细胞因子相比有明显的优势，使得hIL-24迅速成为研究热点。目前IL-24广泛用于多种实体肿瘤如前列腺癌、肺癌、卵巢癌等的基因治疗研究[6-7]。
我们过往的研究表明hIL-24基因在增生性瘢痕的形成过程中起着重要的作用，增生性瘢痕的形成可能与IL-24基因在组织中的表达低下有关[3]。本实验成功构建含有hIL-24基因的重组腺病毒载体，为下步hIL-24在病理性瘢痕中的基因治疗研究做基础。
参考文献
1Gupta P, Su ZZ, Lebedeva IV, et al. Mda-7/IL-24: Multifunctional cancer-specific apoptosis-inducing cytokine. Pharmacol Ther, 2006, 111(3):596-628.
2Fisher PB, Gopalkrishnan RV, Chada S, et al. Mda-7/IL-24, a novel cancer selective apoptosis inducing cytokine gene: from the laboratory into the clinic. Cancer Biol Ther, 2003,2(4): 23-37.
3梁杰,李建赤,罗少军,等.增生性瘢痕组织内IL-24基因mRNA的表达及意义.广东医学院学报,2007,25(2):123-125.
4Luo J, Deng ZL, Luo X, Tang N, et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system.Nat Protoc. 2007;2(5):1236-1247.
5萨姆布鲁克 J,弗里奇 E F,曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南,科学出版社,1993.34-36.
6Zhao L, Dong A, Gu J, et al. The antitumor activity of TRAIL and IL-24 with replicating oncolytic adenovirus in colorectal cancer. Cancer Gene Ther. 2006 Nov;13(11):1011-22.Cancer Gene Ther. 2006,13(11):1011-1022.
7Leath CA 3rd, Kataram M, Bhagavatula P, et al. Infectivity enhanced adenoviral-mediated mda-7/IL-24 gene therapy for ovarian carcinoma. Gynecol Oncol. 2004,94(2):352-362.
