【www.zhangdahai.com--民主生活会发言】
[摘要] 目的:通过动态检测脓毒症兔血IL-6及TNF-α水平变化,探讨行血液灌流最佳时机。方法：将18只新西兰大白兔随机分成6组,通过盲肠结扎穿孔法制作脓毒症模型,分别在术后3、6、12、24、48 h行单次血液灌流,同时设立空灌流组(对照组),并均在手术前，术后3、6、9、12、24、48 h动态检测血清中IL-6及TNF-α水平,记录各组兔子的生存时间。结果：术后12 h行血液灌流组血IL-6平均水平最低(854.2 pg•ml-1),生存时间最长(73.3 h),P 1.2 方法
1.2.1 动物模型制备
参照文献［4］的兔盲肠结扎穿孔法(CLP)制备兔脓毒症模型。自耳缘静脉注入1.5%戊巴比妥钠溶液2 ml•kg-1。腹正中线切开约7 cm,打开腹腔,在阑尾和盲肠交界处用丝线结扎,并将阑尾血管结扎。用直径2.5 mm针头,对穿阑尾3次。检查无活动出血点后回纳盲肠,缝合腹壁。术后维持麻醉状态并继续进行股动静脉置管术。
1.2.2 股动静脉置管
触及右腹股沟动脉波动最明显处后,沿腹股沟切开皮肤约3.5 cm,暴露并分离股动、静脉约3 cm,下穿双丝线。股动脉近心端予动脉夹夹闭后,持预先充满肝素的医用留置针自远心端插入动脉,退针芯,松开动脉夹。结扎及固定动脉前,于动脉和丝线间放入橡胶小软垫(用橡胶手套边缘剪出约1 cm做成,术前碘伏消毒)以防止结扎后右下肢缺血性坏死。股静脉穿刺方法同样。缝合皮肤,盖纱布,外露肝素帽及部分导管,以待行血液灌流用。留置针定时用肝素冲管。
1.2.3 分组
把18只实验兔随机分为6组,每只均按上述依次行盲肠结扎穿孔术(CLP)及动静脉置管,每组3只。6组分别为手术后3 h灌流组(术后3 h组,即盲肠结扎穿孔手术腹壁肌层缝合完毕开始算起3 h后行单次血液灌流,以下分组类似)、术后6 h组、术后12 h组、术后24 h组、术后48 h组及空灌流组(即对照组或空灌组,术后3 h仅行空灌流,灌流器内无吸附剂,仅以肝素生理盐水充满)。每组均按所在组对应术后时间行血液灌流。
1.2.4 血液灌流
兔灌流罐用20 ml注射器制作,内含HA330灌流罐湿树脂15 ml。对照组空灌流器注射器内不含树脂。管路连接为：输血器针头(插入股动脉端留置针肝素帽)→输血器软管35 cm→自制注射器灌流器→输血器软管10 cm→兰格16号软管15 cm→输血器软管15 cm→输血器针头(插入股静脉端肝素帽)。灌流前均已行钴-60辐照消毒,剂量20 KGy。用肝素盐水［含肝素30 mg•(250 ml)-1］预冲管路并在灌流前10 min静脉推注肝素8 mg•kg-1,达肝素化。灌流时间2 h,速度为5 ml•min-1。
1.2.5 观察和检测指标、采集时间
1.2.5.1 观察指标 术后兔均固定于手术台上直至死亡。手术间温度控制在25 ℃左右,每日补充液体量按70 ml•kg-1(生理盐水 ∶10%葡萄糖注射液为1 ∶3),由耳缘静脉或股静脉留置针缓慢滴入,但采血前或灌流前0.5 h暂停补液,以免影响结果。如果兔醒后骚动较剧烈可于静脉端留置针酌情缓慢滴入少量戊巴比妥钠镇静。每日定时观察兔体温、心率、呼吸、精神状态,并记录生存时间(起点为做完CLP时间,终点为兔死亡时间)。
1.2.5.2 检测指标、采集时间 各实验兔均于盲肠结扎穿孔手术前、术后3 h、术后6 h、术后9 h、术后12 h、术后24 h、术后48 h一共7个时间点经过兔耳缘静脉采血,每次2 ml。均通过ELISA法试剂盒集中检测IL-6及TNF-α水平。
每只兔均于术前及术后24 h分别行外周血白细胞计数；并在术后24 h无菌操作下采集静脉血1 ml,注入牛肉汤中37 ℃孵箱中增菌,牛肉汤浑浊后转血平皿,长出单个菌落后进行细菌鉴定。手术前后白细胞计数有明显升高或降低、血培养有致病菌生长的实验兔方可认为脓毒症造模有效；若否,则均需重新再随机抽取实验兔重复实验至造模成功为止。
1.3 统计学处理
计量资料以±s表示,采用统计学软件SPSS 13.0,检验水准α=0.05。生存时间用生存分析Kaplan-Meier法。IL-6及TNF-α水平均用重复测量方差分析,并行两者相关性分析。
2 结 果
2.1 生存结果
结扎穿孔术后约24 h兔开始出现精神倦怠，呼吸、心率逐渐增快等症状,均于术后48 h至80 h间死亡。手术前后白细胞计数均有明显变化,血细菌培养结果均有大肠杆菌生长。3 h组生存时间为（49.333±0.882）h；6 h组为（51.333±1.856）h；12 h组为（73.333±3.528）h；24 h组为（64.667±4.667）h；48 h组为（58.000±3.055）h；空灌流组为(50.667±1.202)h。总体间差异有统计学意义（P=0.001）;3 h组与12 h组、24 h组、48 h组,6 h组与12 h组、24 h组,12 h组与48 h组、空灌流组,24 h组与空灌流组之间比较，差异均有统计学意义（P 本实验中,在排除了血液灌流影响的因素下,空灌流组(对照组)血TNF-α及IL-6浓度均呈一种先升高后降低的变化规律,但两者峰值出现时间不同：TNF-α术后3 h即明显升高,6 h达到峰值,随后逐渐降低；IL-6术后3 h、6 h上升缓慢,9 h陡然升高,12 h达到峰值,随后也逐渐降低。TNF-α及IL-6以有序的方式先后出现,与相关报道［13］符合。研究表明，在脓毒症发展过程中,先是作为炎症介质启动因子的TNF-α产生,然后IL-6等细胞因子紧随出现,后期在抗炎细胞因子(如IL-10)出现后,上述促炎细胞因子逐渐降低。
然而,加入血液灌流因素后,本研究结果可看出，TNF-α及IL-6各有其变化特点：(1) 当在TNF-α上升期(术后3 h)行血液灌流,通过吸附阻断脓毒症启动因子TNF-α上升后,TNF-α值即迅速下降,而在其他时间行血液灌流则对TNF-α影响不大,统计分析TNF-α浓度均值以术后3 h灌流组最低,3 h灌流组在6 h峰值较其他组明显降低甚至高峰消失。原因可能为早期灌流迅速降低血TNF-α,能及时阻断炎症系统和凝血系统的两者相互促进协同作用,即“交互作用”(cross talk),从而能在早期避免TNF-α进一步增加［14-15］。生存分析显示，3 h灌流组生存时间与空灌流组间差异无统计学意义,原因可能与复杂的细胞因子相互作用网络及脓毒症后期抗炎症反应综合征(CARS)有关。(2) IL-6浓度均值以12 h灌流组最低,12 h灌流组在术后12 h达峰值后曲线呈陡然下降趋势,较其他组下降明显；生存分析也显示，以12 h灌流组生存时间最长,与其他组相比较差异有统计学意义。结果提示，在IL-6高峰期行血液灌流,能通过最大限度地减少血IL-6而减轻IL-6对重要组织器官的损伤。故本实验显示，降低IL-6可延长生存时间,改善预后。
相关性分析方面,IL-6及TNF-α无直线相关关系,说明虽然变化线图可看到IL-6随着TNF-α的升高一段时间后而上升,但IL-6的上升并非直接由TNF-α引起,而可能是由IL-1、INF及内毒素等直接诱导产生［16］。
综上所述，血液灌流能有效降低脓毒症兔血TNF-α及IL-6浓度。其中在兔脓毒症早期(盲肠结扎穿孔术后3 h)行血液灌流,能最有效降低血TNF-α浓度；而在兔脓毒症进展中期(盲肠结扎穿孔术后12 h)行血液灌流,不但能最有效降低血IL-6浓度,还能使兔生存时间达到最长；说明血液灌流在兔脓毒症早中期(盲肠结扎穿孔术后3 h至术后12 h）进行,能明显降低前炎症细胞因子,延长生存时间。故对于临床脓毒症病人的治疗,如果能在脓毒症发生及进展早中期行血液灌流,及时阻断炎症瀑布效应和降低炎症因子对组织器官的损伤,就可能会改善脓毒症病人的预后。这对于指导临床脓毒症患者行血液灌流有重要的意义。
［参考文献］
［1］ ANGUS D C, LINDE-ZWIRBLE W T, LIDICKER J, et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care［J］. Cri Care Med, 2001, 29(7):1303-1310．
［2］ INCE C. The microcirculation is the motor of sepsis［J］. Crit Care,2005,9(S4):13-19．
［3］ 王志刚.血液净化学［M].2版.北京:科学技术出版社,2003：213.
［4］ SCHULTZ M J, van der POLL T. Animal and human models for sepsis［J］. Ann Med, 2002,34:573-581．
［5］ FROST R A, NYSTROM G J,LANG C H. Lipopolysac―charide regulates proinflammatory cytokine expression in mouse myoblasts and skeletal muscle［J］. Am J Physiol, 2002,283(3)：698-709.
［6］ WANG P, LI N, LI J S, et al. The role of endotoxin, TNF-alpha. and IL-6 in inducing the state of growth hormone insensitivity［J］. World J Gastroenterol, 2002,8(3)：531．
［7］ PINSKY M R, VINCENT J L, DEVIERE J, et al. Serum cytokine levels in human septic shock. Relation to multiple system organ failure and mortality［J］. Chest, 1993,103(2):565-575．
［8］ WU R Q, XU Y X, SONG X H, et al. Relationship between cytokine mRNA expression and organ damage following cecal ligation and puncture［J］. World J Gastroenterol, 2002,8(1):131-134．
［9］ OBERHOLZER A, OBERHOLZER C, MOLDAWER L L. Sepsis syndromes: understanding the role of innate and acquired immunity［J］. Shock, 2001,16(2):83-96．
［10］ 王�妍,骆璇,王东进,等.乌司他丁对术中单肺通气患者氧自由基、促炎性细胞因子的影响［J］.现代医学,2007,35(6):477-479．
［11］ JERIN A, POZAR-LUKANOVIC N, SOJAR V, et al. Balance of pro-and anti―inflammatory cytokines in liver surgery［J］. Clin Chem Lab Med, 2003,41(7)：899．
［12］ 金永久,张雪梅,陈雁君,等. 血液灌流技术应用及改进的研究进展［J］. 检验医学与临床, 2007,4(10)：982-983．
［13］ 程应东,余争平,姚榛祥,等.脓毒症早期外周血前炎症细胞因子变化的规律与意义［J］.重庆医学,2005,34(2):249-251.
［14］ RICE T W, BERNARD G R. Therapeutic intervention and targets for sepsis［J］. Annu Rev Med, 2005,56：225-248．
［15］ BURNS J P. Septic shock in the pediatric patient: pathogenesis and novel treatments ［J］. Pediatr Emerg Care, 2003,19(2):112-115．
［16］ MOSS E L, HOLLINGWORTH J, REYNOLDS T M. The role of CA125 in clinical practice［J］. Clin Pathol, 2005,58：308-321．
注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”
