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[摘要]目的：观察睾丸固定术前使用盐酸川芎嗪(Ligustrazine Hydrochloride)是否对大鼠隐睾所致的生精细胞凋亡有协同保护作用。方法：22日龄雄性SD大鼠40只，随机分成4组，假手术组(A组)、隐睾组(B组)、睾丸固定术组(C组)、固定术+川芎嗪组(D组)，制作大鼠隐睾模型，D组注射盐酸川芎嗪。14d后，C组和D组行睾丸下降固定术。28 d后测定睾丸组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量，TUNEL法测定生精细胞的凋亡指数。结果：固定术+川芎嗪组隐睾睾丸内SOD活性增强，MDA含量明显下降，生精细胞凋亡指数进一步减低。结论：睾丸下降固定术能够减轻大鼠睾丸生精细胞的凋亡，而固定术前使用川芎嗪对隐睾所致的睾丸生精细胞凋亡有协同保护作用。
[关键词]隐睾；睾丸固定术；生精细胞；凋亡；川芎嗪；Bcl-2／Bax
[中图分类号]R588.1 [文献标识码]A [文章编号]1674-4727(2009)11(b)-015-02
临床上对隐睾的治疗，手术以将睾丸复位至阴囊为主，药物以人绒毛膜促性腺激素促睾丸发育与下降为主，对睾丸损伤，生精细胞凋亡保护方面的药物研究较少，临床上有未及时手术和高位腹腔隐睾患者，这些患者或已有睾丸损伤，即使通过手术将睾丸固定到阴囊内，也面临着成年后不育率升高的风险。本实验拟通过睾丸固定术前使用川芎嗪对隐睾大鼠生精细胞凋亡的影响，观察川芎嗪是否对隐睾所致的睾丸损伤、睾丸生精细胞凋亡有协同保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
实验分4组：假手术组(A组)、隐睾组(B组)、睾丸固定术组(C组)、固定术+川芎嗪组(D组)，每组大鼠各10只。雄性SD大鼠，日龄22d，体重50～60g。由辽宁医学院实验动物中心提供。
1.2 动物模型的建立
手术于辽宁医学院实验动物中心手术室进行，除A组外，各组在大鼠22日龄时制作单侧隐睾模型，10％水合氯醛0.3 ml／kg腹腔麻醉，腹正中切口，切断左侧睾丸引带，用7-0无创伤线将左侧睾丸固定于后腹壁。A组只牵拉左侧睾丸引带，不切断，用7-0无创伤线缝睾丸引带一针并结扎，立即将睾丸还纳至阴囊，分两层关腹。其中，D组模型制作后，腹腔注射盐酸川芎嗪，剂量25 mdkg，1次／d，连用2周。其他组注射同等剂量的生理盐水。隐睾模型术后14 d，C组和D组行睾丸下降固定术。腹腔麻醉后，下腹正中切口，将睾丸游离后还至阴囊，用7-0无创伤线将睾丸固定于阴囊内膜上。
1.3 标本收集及处理
在睾丸固定术后第28天(即大鼠64日龄时)，用快速脱颈椎法处死所有大鼠，留取左侧睾丸，电子天平称重后制作石蜡切片，部分组织用于测定超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。
1.4 SOD、MDA的测定
采用南京建成生物工程研究所提供的SOD、MDA试剂盒，用化学比色法，通过分光光度计比色，计算SOD、MDA的含量。
1.5 TUNEL法原位细胞凋亡检测
用生物素-dUTP／酶标亲和素测定法检测睾丸生殖细胞凋亡(TUNEL法)，方法及步骤严格按照试剂说明书进行，试剂购自南京凯基生物科技发展有限公司。阴性对照组不加末端转移酶，凋亡细胞胞核呈棕褐色。每个标本计数50个生精小管截面中的凋亡细胞，计算每个生精小管截面的平均凋亡细胞数。
1.6 数据统计方法
采用单因素方差分析，所有数据以均数+标准差来表示。应用SPSS13.0软件进行统计分析，组间比较采用SNK-q检验法，以P0.05)。
2.2 TUNEL法检测生精细胞凋亡指数
C组生精小管内凋亡细胞较B组明显减少，但凋亡指数仍略高于A组。而D组生精小管内凋亡细胞相对较少，凋亡指数低于C组(P0.05)，且生精小管内生精细胞的数量明显增多。
3 讨论
临床对隐睾的治疗以手术将异位睾丸复位至温度适宜的阴囊为主，手术应尽早进行。隐睾患儿在出生后2年内生精小管就开始萎缩，精原细胞数呈进行性减少。有研究表明，如果在2岁之前进行睾丸固定术，生育率能恢复到87.5％，而如果在13岁或者更晚的时候进行，其生育率则下降到14％。另有研究显示，单侧隐睾患儿在9个月龄进行睾丸固定术，睾丸发育明显优于在3周岁时手术患儿。有研究表明，睾丸下降固定能使大鼠隐睾恢复正常的生精过程，在性成熟之前，隐睾下降固定能促进生精过程的恢复和逆转生殖细胞的退化；然而对于成年的大鼠隐睾，下降固定不能恢复其正常的生精过程。
Rusnack等研究发现，高位型隐睾固定术患者的睾丸活检均为重度受损，双侧隐睾即使早期治疗，不育率仍大于60％，单侧隐睾不育率达25％。热作用后，除了较早一段时期对精母细胞、精子细胞及精子的影响外，长时期内精原细胞的再生能力受到影响，在恢复期精原细胞比正常情况下的精原细胞凋亡增加。因此，隐睾会使睾丸生精细胞凋亡增加，隐睾下降固定能通过减少生精细胞凋亡而改善生精功能，部分隐睾固定术后仍不能完全恢复生育力可能与生精细胞凋亡仍较正常睾丸高有关。
川芎嗪是从川芎中提取一种生物碱单体：4-甲基吡嗪，可以保护血管内皮细胞功能，还可以增强SOD及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活力，促进纤维蛋白溶解17，具有直接清除氧自由基及促进内皮细胞合成一氧化氮(No)作用。本实验说明川芎嗪抑制了生精细胞凋亡，促进了隐睾睾丸生精功能的改善，为临床上隐睾的治疗提供新的思路。
