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【摘要】 目的 探讨抑癌基因PTEN在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义。方法 采用PCR法观察40例膀胱移行细胞癌标本中PTEN的表达情况。结果 40例膀胱移行细胞癌组织中9例(22．5%)PTEN表达阳性。随着肿瘤分期的进展PTEN的改变有增高的趋势但与肿瘤的分级无显著相关性。结论 PTEN异常表达在膀胱移行细胞癌的进展中有重要作用，PTEN基因可作为评价膀胱移行细胞癌进展及预后的指标。
【关键词】膀胱肿瘤; PTEN
Expression and significance of PTEN in bladder transitional cell carcinoma
ZHAO Hai-yan，YANG Guang-tian，ZHANG Zhi-gang,et al.Department of Urology，Lianyungang Hospital Affiliated of Xuzhou Medical College,Jiangsu Province 222000,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of PTEN in bladder transitional cell carcinoma(BTCC)and its clinical significance.Methods Tumor samples from 40 patients with BTCC were analyzed its relationship with PTEN by PCR.Results The positive rate of PTEN was 22．5% in bladder transitional cell carcinoma.The result was not associated with grade of the tumor.The positive rate of PTEN was associated with stage of the tumor.Conclusion The abnormal expression of PTEN may play an important role in the development of bladder transitional cell carcinoma.The measurement of PTEN may have a guiding significance in BTCC.
【Key words】
Bladder neoplasms; PTEN
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其中膀胱移行细胞癌(BTCC)占80%～90%[1]，其发病机理至今仍不清楚，一般认为与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关[2]，我们用PCR法检测抑癌基因PTEN坐位的LOH，对其在BTCC中的表达及临床意义进行探讨。
1 材料与方法
1．1 标本来源 40例膀胱移行细胞癌组织及相应外周血标本为我科2003年9月至2006年2月间手术切除的新鲜标本，均经膀胱镜活检、经尿道膀胱肿瘤电切及开放手术后病理证实为BTCC，患者年龄30～85岁，平均59．88岁，其中男32例，女8例。临床及病理分级分别是GⅠ9例，GⅡ21例，GⅢ10例；Tis～T�1期13例，T2～T4期27例。标本离体后立即置入液氮罐；手术前日抽患者外周静脉血10 ml加ACD液抗凝，二者编号保存在-76℃超低温冰箱中备用。另取20例正常膀胱黏膜标本做对照，标本采集方法同上。
1．2 DNA的提取 上述标本经蛋白酶K消化后,采用经典的酚-氯仿-异戊醇抽提法稍加改进提取标本DNA，紫外分光光度计定量后稀释至浓度100 mg/L备用。
1．3 引物设计 参阅文献，PTEN引物序列特征见表1。
1．4 PCR扩增 在50 μl反应体系中，加入基因组DNA100 ng，10×PCR缓冲液5 μl,25 mmol/L MgCl2 3 μl，2 mmol/L dNTP混合液5 μl，上�下游引物各1 μl(20 μg/200 μl)，Taq DNA聚合酶1．5 U，蒸馏水37 μl，石蜡油(封闭)40 μl：PCR反应条件:变性95℃ 5 min，94℃ 1 min，退火条件53℃ 1 min，延伸条件72℃ 1．5 min，27个周期循环，而后72℃保持10 min延伸。
1．5 8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：配制并灌制8%变性聚丙烯酰胺凝胶，大小为20 cm×30 cm×0．04 cm，1～1．5 h自然凝固后，撕去底边胶带，固定在垂直电泳槽上。上下槽均灌注同批次配制的1×TBE，预电泳15 min。取PCR产物10 μl加2×甲酰胺上样缓冲液2 μl，95℃ 8 min变性后快速置入冰块，冲净加样孔，点样。电泳条件:电压800 V，电流0．05 A，功率50 W，室温下电泳1．5～2 h，据示踪剂的位置判断产物泳动的位置。电泳毕将胶放在0．2%的硝酸银溶液中浸泡20 min染色。取出后去离子水清洗，清洗后于1．5%NaOH加0．4%甲醛溶液中显色5 s，密度分析。
1．6 统计分析 采用SPSS11．5软件分析，多因素分析采用Logistic回归分析。P2检验，P>0．05，即PTEN在膀胱肿瘤中的阳性率与肿瘤的分级无显著关联。
2．3 PTEN与肿瘤分期的关系 见表3。
从上表可知，PTEN阳性率与分期关系不显著，P值为0．123，OR值3．364,其阳性率具有随着分期增加而增高的趋势。
3 讨论
肿瘤抑癌基因(tumor suppressor genes，TSG)是人类正常细胞中所具有的一类与原癌基因共同调节细胞增殖分化的基因，在正常细胞的增殖、分化和凋亡中，TSG起着负调控作用，抑制细胞进入增殖周期，诱导终末分化和细胞凋亡，维持基因稳定，具有潜在抑制肿瘤生长的功能。TSG的丢失被认为是肿瘤发生的必要条件，如果TSG的基因位点由1条野生型和一条失活的等位基因组成，此时的个体具有发生恶性肿瘤的倾向。在第2条野生型等位基因丢失后，恶性表型就表现出来，称为杂合性缺失(Loss of heterozygosity，LOH)，即一个位点上两个多态性的等位基因中的一个出现缺失[3]。对杂合性基因型人群进行抑癌基因座位或其相邻区域的LOH检查，可为TSG在染色体上的定位提供线索[4]。
PTEN(phosphatase and tensin homlogy deleted on chromosome ten)基因是1997年由Steck等研究小组发现并命名的一种基因,是迄今为止发现的第一个具有磷酸酪氨酸酶和双重特异性磷酸酶(DSP)活性的抑癌基因，其蛋白产物具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性,有诱发细胞凋亡、调节细胞周期、抑制细胞迁移、铺展和局部黏附等功能。体细胞中PTEN的异常表达见于人类各种散发性肿瘤[5-8]。在肿瘤的发生过程中，PTEN基因的丢失可能会导致磷酸酶通路不正常激活，细胞凋亡受抑制，允许本应死亡的细胞无节制生长。另外，PETN丢失则抑制细胞迁移、铺展和局部黏附等功能丧失，而此功能与晚期癌症的进展，尤其是癌症的恶化和转移有关。
Hubichi等在对123例膀胱癌患者中的PTEN进行分析，53例(P2)的肿瘤中PTEN丢失达32%(17/33)，而60例(PTa/T1)患者发生LOH为6．6%(4/60)，进一步研究无点突变。在对15株膀胱癌细胞系进行研究，有3株发生PTEN基因同源性丢失，但无点突变[9]。Cairns等用微卫星法分析285例膀胱癌，发现10q有较高的缺失率,他们用微卫星法分析65例(23%)存在LOH，Ta期8%,T1期20%,T2期为29%。他们认为PTEN的丢失发生在高级别的膀胱癌中[10]。本实验中PTEN出现LOH改变的有9例标本，占22．5%，其中Tis～T1期有1例，T2～T4期占到8例，GI 2例，GII 6例，GIII 1例，统计资料说明随肿瘤分期的进展PTEN的改变有增高的趋势但与肿瘤的分级无显著相关性，Logistic回归分析显示随着分期的每增加一个等级所引起的比数比(即PTEN阳性率的近似相对危险度)为增加前的3．364倍，说明了二者的相关性，同时PTEN的改变在膀胱肿瘤中总体阳性率不高，这与文献报道一致，分析此结果的出现可能是PTEN还通过其他方式丢失导致，尚需进一步研究。
综上所述，鉴于PTEN基因在膀胱肿瘤中存在突变，在信号转导和细胞的各种生理过程中都有较复杂的重要效应，因此有理由推断PTEN具有较强的抑癌功能及调节细胞信号转导通路的功能，可被引入膀胱肿瘤的基因治疗，并有望获得新的有效方法。
参考文献
1 Malmstrom PU,Busch C,Norler BJ,et al.Recurrence progression and survival in bladder cancer:a retrospective analysis of 232 patiens with greater than or equal to 5-year follow-up.Scand J Urol Nephrol,1987,21:185-195.
2 Fearon ER，Feinberg AP，Hamiton SH，et al.Loss of genes on the short arm of chromosome 11 in bladder cancer.Nature,1985,318:377-380.
3 Cavenee WK，Dryja TP，Phillips RA，et al.Expression of recessive alleles by chromosomal machanisma in retinoblastoma.Nature，1983，305:779.
4 刘柄文,陈俊杰.医学分子生物学.中国协和医科大学出版社,2000.
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6 Li J，Yen C，Liaw D，et al.PTEN，a putative proteni tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，and prostate cancer.Science，1997,275(5308):1943-1947.
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8 Persad S，Attwell S，Gray V，et al.Inhibition of integrinlinkedkinase(ILK)suppresses activation of prote in kinaseB/Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN-mutant prostate cancer cells.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:3207-3212.
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10 Cairns P,Evron E，Okami K，et al.Point Mutation and Homozygous Deletion of PTEN/MMAC1 in Primary Bladder Cancers.Oncogene，1998,16(24):3215-3218.
