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文章编号：1005-619X（2007）02-0065-04 【摘 要】 目的 分析矽肺病人大容量全肺灌洗回收液（Massive Whole-lung Lavage Fluent,WLLF）中提取的AM中TGF-β1表达情况及AM培养上清对FB刺激后FB增殖和TGF-β1表达的情况。方法 矽肺病人的WLLF中获得AM，用无血清1640培养不同时间后，收集培养上清并作用于FB。采用免疫细胞化学法检测AM与FB的TGF-β1的表达情况，结合自动图像分析系统对其结果进行半定量分析；采用MTT比色法、细胞分裂指数法检测FB的增殖情况。结果 ①矽肺病人的AM表达TGF-β1，随时间点的延长，其表达逐渐增强。②各时间点AM培养上清均有促FB增殖的作用，加入TGF-β1的抗体，这种促FB增殖的作用受到抑制。③AM的24小时培养上清有促进FB增殖及转化生长因子-β1表达的作用。结论 ①矽肺病人灌洗的AM表达TGF-β1，其培养上清对FB有促增殖作用，TGF-β1的抗体对此作用有抑制作用，提示TGF-β1在矽肺发生中起重要作用。②矽肺病人的AM培养上清可以诱导FB的TGF-β1表达，提示FB存在TGF-β1的自分泌机制，在矽肺的发病过程中可能起相当的作用。
【关键词】 矽肺；肺泡巨噬细胞；成纤维细胞；转化生长因子
1 引言
矽肺是一种严重影响劳动能力的职业病，病因清楚，但发病机理至今尚未阐明。一般认为， SiO2粉尘颗粒被肺内巨噬细胞吞噬后，巨噬细胞大量死亡崩解或发生功能和生物学行为改变，释放致纤维化因子，如转化生长因子（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、白介素（Iinterleukin 1,IL-1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis growth factor,TNF）、胰岛素生长因子（insulin-like growth factor,IGF）等，增加肺内细胞外基质成分的合成与分泌，导致肺纤维化。其中，TGF-β1可刺激肺FB合成大量胶原，同时，它还可抑制蛋白水解酶的活性，减少细胞外基质的降解，使细胞外基质沉积增多，所以TGF-β1在诸多纤维化疾病的研究中愈来愈受到重视。以往关于TGF-β1的试验都是采用动物标本，与人的生理情况不尽相同。本研究通过矽肺病人大容量全肺灌洗液收集肺泡巨噬细胞，培养不同的时间后获取培养上清，检测AM的TGF-β1表达情况。再用AM培养上清作用于人胚肺FB，检测FB的TGF-β1表达，同时检测成纤维细胞的增殖情况，以期为拓宽矽肺纤维化的防治途径进一步提供试验依据。
2 材料与方法
2.1 AM取自在国家煤矿安全监察局尘肺病康复中心进行肺灌洗的病人的灌洗回收液,经 4℃2000r/min离心两次，每次15分钟。加入含10％胎牛血清的1640培养液，37℃培养1.5h，使巨噬细胞贴壁，在无菌操作台内，弃去培养液，用PBS洗涤三次去除残余的血清。按分组条件，重新加入无血清的1640培养液，在37℃5％CO2培养箱内培养至相应时间后收取培养上清和小盖片，培养上清经0.22μm滤膜过滤，－70℃保存备用。盖片用PBS漂洗三次，4％多聚甲醛固定10分钟，低温保存，用于免疫细胞化学检测TGF-β1。
2.2 方法
2.2.1 试验分组
AM分组：无血清1640培养3h、6h、12h、18h、24h后收集各时间点培养液；FB分组：①10％血清组（C10）：含10％胎牛血清的1640培养液培养FB；②无血清组（C0）：无血清的1640培养液培养FB；③上清刺激组（F）：AM培养上清作用于FB；④抗体组(A)：TGF-β1抗体与AM培养上清共同作用于FB。
2.2.2 试验步骤 运用免疫细胞化学检测TGF-β1； MTT法检测人胚肺FB增殖；细胞分裂指数法检测人胚肺FB的增殖；免疫细胞化学法检测FB细胞TGF-β1表达。
2.3 统计学处理
采用SPSS 11.0软件进行统计学处理，所得计量资料数值以均数±标准差（x±s）表示，两组均数之间的比较用t检验，三组或三组以上比较用方差分析。P＜0.05为差异有显著性,P＜0.01为差异有极显著性。
3 结果
3.1 培养不同时间AM细胞的TGF-β1表达情况随培养时间的延长，染色强度出现持续升高的趋势。各时间点积分光密度值之间比较均有统计学差异（表1）。
3.2MTT法检测AM的不同时间点培养上清对FB增殖的影响
AM的不同时间点培养上清作用于FB后所测OD值与无血清培养组相比有显著性差异,说明其有促进FB增殖的作用,但促进FB增殖的效应不如10％胎牛血清组。各时间点培养上清作用于FB后所测OD值中，以3小时、18小时、24小时培养上清促FB增殖的作用显著。24小时培养上清的促FB增殖的作用比18小时略降低，但比3 小时作用强。统计结果表明，18小时与24小时相比差异不显著，但与其他时间点比较有显著性差异（表2）。
3.3 细胞分裂指数测定
FB细胞与AM的24小时培养上清共同孵育24h、48h、72h后，其FB爬片经Giemsa染色计数分裂指数，分裂指数计算结果（表3）。由表可以看出AM培养上清有明显的促分裂增殖作用。统计分析显示，无血清组细胞分裂指数在3个时间点基本不变，无统计学差异。上清刺激组与无血清组比较有显著性差异，与抗体组相比各时间点均有统计学差异，说明TGF-β1抗体抑制了矽肺病人AM培养上清内的TGF-β1蛋白的促增值分裂的作用，其抑制率在24小时至72小时分别为39.61％、36.36％、32.62％。本试验结果进一步表明矽肺病人AM培养上清能明显促进FB增殖，TGF-β1是上清中重要的促增殖因子。
3.4AM培养上清对FB的TGF-β1蛋白表达的影响
各组FB爬片在同一条件下进行免疫细胞化学染色检测TGF-β1。上清刺激组的FB分别培养不同时间后与同期无血清组比较，12小时前蛋白表达是增强的。两组FB染色均出现先升高再降低、又升高再降低的趋势。12小时前上清刺激组与无血清组相比积分光密度值较高，两组相比有统计学差异，各组内相邻时间点之间相比也有统计学差异（表4）。
4 讨论
许多慢性肺间质性疾病，包括矽肺在内均与小气道持续的炎性细胞激活有关。AM的激活是这一过程的中心环节[1,2]。AM吞噬SiO2后分泌多种细胞因子,后者对FB具有趋化作用,促进其增殖并影响胶原和其他细胞外基质的合成与分解代谢。在众多的AM来源的细胞因子中, TGF-β1是研究的比较深入的一种因子。近年来的研究多使用小鼠模型，动物试验与动物来源的细胞与人的生理情况有一定差别，为此本试验选择矽肺病人大容量全肺灌洗液中的AM与人胚FB来进一步研究TGF-β1与矽肺的关系。
4.1 大容量全肺灌洗液中AM细胞的TGF-β1表达
Cooper等[3]研究表明，大鼠气道内滴注博来霉素在不同的时间作用点做肺组织TGF-β1免疫组化染色显示：在用博来霉素2小时～4天，TGF-β1主要定位于支气管上皮细胞；4～7天，AM中的TGF-β1的表达量上升；7天后，TGF-β1主要定位于肺泡炎和基质沉积部位。在肺纤维化早期，TGF-β1染色阳性的细胞主要是AM，肺纤维化终末期TGF-β1染色阳性的细胞主要是上皮细胞和巨噬细胞；而在未经博来霉素处理的小鼠的肺泡腔内偶见TGF-β1弱阳性的AM，本试验结果说明AM是WALLF中TGF-β1的主要来源细胞。周红等[4]研究发现，在染尘大鼠肺中，TGF-β1阳性染色在AM最强，染尘第二周AM被广泛染色，第八周染色强度最高，肺纤维化病灶区尤为明显。本试验的AM来自Ⅰ＋期矽肺患者的大容量全肺灌洗液（WALLF）。我们的试验结果表明矽肺病人WALLF中提取的AM随培养时间的延长，其TGF-β1阳性染色逐渐加强，与文献报道基本一致。
4.2 矽肺病人的AM培养上清对人肺FB具有促增殖作用
AM培养上清中含有多种细胞因子，包括IL-1、IGF、TGF、TNF、PDGF等，其促增殖作用是这些细胞因子构成的细胞因子网络综合作用的结果。国内外学者研究肺纤维化发病机制的焦点是这些细胞因子的来源和表达水平。 TGF-β是致纤维化关键性的细胞因子，而TGF-β1在TGF-β家族中起到重要的作用，它通过将细胞生长滞留于G1期，阻止进入S期而抑制上皮细胞的生长。有文献报道，在多种因素导致的肺纤维化中均发现TGF-β含量增高[5，7]。给予TGF-β单克隆抗体后FB增生受到明显抑制，并呈剂量依赖关系。在肺纤维化的动物模型中，肺组织中前胶原Ⅰ和Ⅱ含量在给予TGF-β1单克隆抗体后减少了40％和12％，肺泡炎和肺纤维化程度有所减轻[8]。
TGF-β1对FB作用有两方面：一方面它刺激FB合成细胞外基质，如胶原、纤维连接蛋白、基质受体和糖蛋白等；另一方面抑制对新合成的基质蛋白产生的酶解作用[9]。另外，AM培养上清中含有的多种细胞因子对于TGF-β的增殖作用是相互影响的。TGF-β可以通过趋化单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等，从而促进IL-1、TNF、PDGF等细胞因子合成增加，它与IGF在刺激间质FB增殖与新生胶原在肺内沉积存在互补作用[10]。
本研究采用MTT法检测矽肺病人AM的不同时间点培养上清对无血清培养的FB细胞的促增殖作用，结果表明：AM的不同时间点培养上清能够显著促进FB增殖，其促增值作用强于无血清培养组。18小时和24小时培养点的AM培养上清促FB增殖作用较强，与不同时间AM细胞的TGF-β1表达情况基本一致。此外，试验运用细胞分裂指数来证明AM培养上清对人肺FB具有促增殖作用。细胞分裂指数是直接反映增殖情况的指标。试验结果显示：在无血清培养条件下，24小时、48小时、72小时AM培养上清对FB有促增殖作用，加入TGF-β1抗体，可抑制促增殖作用。说明TGF-β1是AM培养上清中促FB增殖的重要成分。
我们用二种方法都检测出矽肺病人的AM培养上清对FB有促增殖的作用，而TGF-β1抗体可以抑制这种作用，说明TGF-β1是AM培养上清中促FB增殖的重要成分。
4.3 AM培养上清对FB的TGF-β1蛋白表达的影响
本试验运用免疫细胞化学法检测了FB的TGF-β1蛋白表达情况。加入AM的24小时培养上清后FB的TGF-β1蛋白表达从3～12小时比单纯无血清培养的FB的TGF-β1蛋白表达增多，两组的表达高峰时间均在6小时。试验结果表明：TGF-β1也能促进FB自身合成TGF-β1，FB的这种自分泌作用也是导致肺纤维化进展的重要原因之一。
本试验通过矽肺病人的WLL中提取的AM，经过不同时间的培养上清对人胚肺FB作用，采用免疫组化等方法，在蛋白水平证明了矽肺病人的AM培养上清对TGF-β1的表达具有促进作用。我们认为，TGF-β1对人FB有重要的促增殖作用，除了经旁分泌来的TGF-β1以外，人FB也通过自分泌TGF-β1进一步促进增殖作用。
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