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【摘要】 目的：研究了快速分离高通量高效液相色谱法测定虎杖样品中的大黄素和大黄素甲醚。方法：虎杖样品提取液以Agilent zobax C18 (4.6 mm×50mm×3.5?m)快速分离色谱柱为固定相，乙腈-0.1 %高氯酸为流动相进行梯度洗脱，流速为1mL.min-1，用紫外检测器检测,检测波长为432nm。结果：大黄素和大黄素甲醚的标准回收率分别为94%~102% 和 93%~96%； RSD分别为0.6%~3.2% 和 1.1%~2.3%。结论：用该方法测定了虎杖中的大黄素和大黄素甲醚，结果令人满意。
【关键词】 虎杖；大黄素；大黄素甲醚；高效液相色谱法
【Abstract】Objective： A rapid high performance liquid chromatography method（HPLC）for the determination of emodin and physcion in polygonum cuspidatum was studied. Method：Emodin and physcion can be separated on a Agilent zobax Eclipse XDB-C18 (4.6mm×50mm×3.5μm). The mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%HClO4 in gradient mode.The flow rate was 1.0mL min-1. The wavelength of the measurement was 432nm. Emodin and physcion in polygonum cuspidatum were monitored by SPD, and determined by this method. Result: The recovery of emodin and physcion was respectively 94%~102% and 93%~96% The relative standard deviation of emodin and physcion was respectively 0.6%~3.2% and 1.1%~2.3%. Conclusion: The method was applied to the determination of emodin and physcion in Polygonum cuspidatum with good result.
【Keywords】Polygonum cuspidatum；Emodin；physcion；HPLC
虎杖为蓼科植物（Polygonem cuspidutum Sieb.et Zucc）虎杖的干燥根茎和根，春秋二季采挖，味微苦、涩，有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功效，主要用于湿热黄疸，淋浊，带下，风湿痹痛，痈肿疮毒，水火烫伤，闭经，跌打损伤，肺热咳嗽等症[1]。虎杖中含有大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等抗炎、抑菌、抗病毒及抗肿瘤的作用的蒽醌类化合物[3-6]，也含有虎杖苷、白藜芦醇等具有抗氧化、抗肿瘤的非蒽醌类化合物。目前，蒽醌类化合物的测定常用高效液相色谱法，但通常会出现分离时间较长，溶剂的消耗量较大，分离度不太理想等缺点[7]。针对以上缺点，本文通过采用Agilent ZOBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm×50 mm,3.5μm）高通量快速分离色谱柱，优化流动相，优化检测波长等方法实现了虎杖中蒽醌类化合物的分离。此方法具有分离时间较短，柱压较底，流动相消耗较少等优点，同时采用双指标法对虎杖进行质量控制具有一定的意义。
1实验部分
1.1仪器和试剂
SPD-10Avp紫外检测器：SHIMADZU；LC-10ATvp二元泵：SHIMADZU；SK2200LH超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；UV-4802双光束紫外可见分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司；AUW120D电子天平：SHIMADZU。大黄素：中国药品生物制品鉴定所（110756-200110）；大黄素甲醚：中国药品生物制品鉴定所（110756-200110）；乙腈：色谱纯；其他所用溶剂均为分析纯；水：二次蒸馏水；虎杖：购于怀化市医药公司。
1.2储备液制备
取大黄素和大黄素甲醚对照品，放入五氧化二磷干燥器中干燥24h。精密称取大黄素0.00501g，用10mL的甲醇溶解，并定容至50mL， 即得0.1002mg.mL-1的大黄素储备液；精密称取大黄素甲醚0.00500g，用约10 mL乙醇溶解，再用甲醇定容至50mL， 即得0.1000mg.mL-1的大黄素甲醚储备液。
2方法与结果
2.1样品处理
取少量已经干燥的大黄粉，过80目筛，精密称取0.20g于具塞锥形瓶中，加入甲醇10mL，超声提取30min，同法提取3次，过滤，转入100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。
2.2色谱条件
色谱柱：美国Agilent ZOBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm×50 mm,3.5μm）色谱柱；流动相：A-B=乙腈-0.1%高氯酸水溶液：0.00min~5.00min，A 25%~25%；5min~12 min，A 25%~50%；12min~15 min，A 50%~85%；15min~20min，A 85%~85%；流速1mL.min~1；进样量20μL。在上述色谱条件下，分别取样品溶液和对照品溶液用0.45μm针头过滤器过滤，在432nm的检测波长下进样20μL，得色谱图见图1,大黄素的保留时间为16.265min,大黄素甲醚的保留时间为18.198min，且分离度好。
2.3分离条件的选择
实验了不同浓度的甲醇-水作流动相进行等度洗脱，大黄素和大黄素甲醚与其他色谱峰得不到较好的分离；用不同浓度的乙腈-水作流动相，乙腈浓度较大时峰重叠严重，乙腈浓度较小时分离时间较长，且峰型拖尾现象严重，这主要是由于蒽醌类物质酚羟基产生电离，在固定相表面出现双重保留机制的缘故；用乙腈-0.1%高氯酸溶液作为流动相进行梯度洗脱，蒽醌类物质基本都能得到较好分离，又能使蒽醌羟基电离得到抑制，分离效果和峰型均得到较大的改善。实验了不同比例的流动相，当乙腈：0.1%高氯酸溶液为以上色谱条件时大黄素和大黄素甲醚与其它成分达到较好的基线分离。
2.4测试波长的选择
作为对蒽醌类化合物的测定，本实验对大黄素、大黄素甲醚、大黄酸和大黄酚等溶液的紫外吸收进行考察发现，蒽醌类化合物在432nm左右均有最大吸收，且强度较大，而非蒽醌类化合物在432nm处吸收较少或没有吸收，因此选定波长为432nm进行实验，其他物质对待测物干扰较少。
2.5线性关系的考察
分别精密吸取0.5μL、1.0μL、2.0μL、4.0μL、8.0μL浓度为0.1002mg.mL-1大黄素和浓度为0.1000mg.mL-1的大黄素甲醚储备液进样，用浓度C对峰面积A作图，回归方程分别为：
结果表明，大黄素在0.050μg~0.802μg之间，大黄素甲醚在0.050μg～0.800μg之间，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
2.6精密度实验
取浓度为0.1002mg.mL-1的大黄素储备液和浓度为0.1000mg.mL-1的大黄素甲醚储备液1mL，分别转移至25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，并按2.2项色谱方法重复进样5次，大黄素峰面积的RSD为0.79%，大黄素甲醚峰面积的RSD为1.03%。
2.7重复性实验
取同一批次的虎杖粉末5份，每份0.2g，按照2.3项处理得样品溶液，并按照2.2项色谱条件进样，分别计算含量，大黄素RSD为0.95%，大黄素甲醚RSD为1.12%。
2.8稳定性考察
取同一批次按2.1项方法处理的样品溶液，按照2.2项色谱条件分别于0、1、3、6、8、12、24h进样一次，计算大黄素和大黄素甲醚的含量，则大黄素RSD为1.01%,大黄素甲醚RSD为1.09%。
2.9回收率实验
精确称取5个批次已知含量的虎杖粉末0.20g，分别加入0.5mg大黄素和0.2mg大黄素甲醚对照品，按2.3法进行样品处理，并按2.4法进行富集和进样，通过大黄素的测出量计算大黄素的回收率，并计算其相对标准偏差（见表1）。
2.10样品分析
取不同产地虎杖，于100℃下干燥4小时，粉碎，按照2.1项配成样品溶液，按照2.2项下色谱条件，分析结果见表2。
3讨论
3.1大黄素和大黄素甲醚均为蒽醌类化合物，在200nm~250nm有最强吸收，在430nm左右有次强吸收，但在最强吸收处其他成分的干扰较为严重，而432nm干扰较少，故本实验选用测定波长为432nm。
3.2本实验采用不同的流动相对待测物进行分离，发现用乙腈-0.1%高氯酸水溶液并用以上色谱条件梯度洗脱色谱峰峰形较好，待测物与其他物质分离度较大。
3.3虎杖中蒽醌类化合物的提取主要用水和醇回流提取，但提取时间长，能耗高，提取效率低。本实验用甲醇作溶剂，超声提取三次，经检测，大黄素和大黄素甲醚基本提取完全。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部，北京：化学工业出版社，2010.
[2]樊小容.虎杖对致病菌株药敏试验[J] .时珍国医国药，2000.
[3]张长生，曾志良，李骊.复方虎杖液对四种致病性真菌的抑菌试验报告[J].湖北中医学院学报，2000.
