【www.zhangdahai.com--学习雷锋心得体会】
(1.济南市历城区中医院 山东济南 250100；2.山东省泰安市中心医院 山东泰安 271000) ��［摘 要］ 目的探讨Survivin基因在大鼠心肌缺血预适应中的表达及其与心肌细胞凋亡的关系。方法36只大鼠随机分为缺血预适应组、单纯缺血组和正常组三组。分别检测三组大鼠心肌中Survivin mRNA和心肌细胞凋亡率。结果缺血预适应组SurvivinmRNA的表达水平最高，单纯缺血组表达水平较缺血预适应组降低，正常组只有微弱的表达。单纯缺血组大鼠心肌细胞凋亡率最高，缺血预适应组大鼠心肌细胞凋亡率较单纯缺血组大鼠低。结论在心肌缺血过程中Survivin可以减少心肌细胞的凋亡，具有心脏保护作用。
［关键词］心肌缺血；凋亡抑制基因；Survivin；缺血预适应；基因表达；细胞凋亡�
［中图分类号］ R363［文献标识码］ A［文章编号］ 1672-4208(2008)21-0015-02
�
Survivin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成员，可与caspase-3和easpase-7结合抑制caspase的活性，通过与细胞分裂微管结合，抑制细胞凋亡。病理情况下，Survivin表达于多数恶性肿瘤，在肿瘤的发病机制中有重要作用�[1-2]。本实验通过检测大鼠缺血心肌中Survivin基因的表达水平，探讨它在心肌细胞凋亡中的作用。�
1 材料与方法�
1.1 动物准备与分组 雄性Wistar大鼠36只，体重200～250 g，由山东大学实验动物中心提供。随机分为三组：缺血预适应组、单纯缺血组和正常组。每组大鼠12只。每组中6只大鼠取心脏匀浆用于SurvivinmRNA的检测，另外6只取心脏固定后进行细胞凋亡的检测。�
1.2 主要试剂 mRNA提取、RT-PCR和原位凋亡检测(TUNEL)试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。�
1.3 模型制作 以1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(45mg/kg)，右颈动脉插管，经换能器连接八导生理记录仪，监测心电图和血流动力学。气管插管，通气频率60次/min，开胸，以6/0线在距冠状动脉前降支根部1～2 mm系一个活结，观察心电图变化，ST抬高或降低均为结扎成功，结扎线以下心肌组织颜色变暗。缺血预适应组短暂缺血5 min后打开活结，再灌注5 min，然后再次结扎冠状动脉30min后处死大鼠取心脏，分别进行各项检测。单纯缺血组直接结扎冠状动脉30 min后处死大鼠。正常组只穿线，但不结扎冠状动脉，30 min后处死大鼠。�
1.4 总RNA提取 取大鼠心脏，在液氮中磨碎成粉末状，每50～100 mg组织加1 ml TRIzol试剂，用匀浆器进行匀浆；将细胞裂解液转移至离心管中，在室温下放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离；12 000 g，4℃离心10 min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中；加入氯仿，激烈振荡15 s，室温静置3 min；12 000 g，4℃离心15 min，小心吸取无色上清水相移至另一离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10 min；12 000 g，4℃离心10 min，去除上清，加入1 ml 75%的乙醇，混匀。12 000 g，4℃离心10 min，吸尽上清，室温干燥沉淀2～5 min，加入30～50 μL的无RNAse水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70℃保存。�
1.5 cDNA的合成 20 μl体系，包括样品RNA 3 μl，DEPC水90 μl，dNTP 9 μl，10×buffer 36 μl，Oligo(DT)9 μl，M-MLV 9 μl。反应条件为37℃1 h，95℃5 min，4℃2 h。1.6 DNA扩增（PCR） 50 μl体系，包括上下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，10×buffer 5 μl，MgCl�2 4 μl，TaqDNA聚合酶0.2 μl，dNTP 0.5 μl，DEPC水36.3 μl。内参应用β-actin，上游引物：5’-GCATGGAGTCCTGTGGCAT-3’，下游引物5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGG-3’，320 bp；Survivin上游引物：5’-CTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAA-3’，下游引物：5’-AATAAACCCTGGAAGTGGTGCA-3’，279 bp�[3]。反应条件为95℃5 min，（94℃45 s，56℃45 s，72℃45 s，35个循环），72℃7 min。�
1.7 RT-PCR产物的检测 先将10μlPCR产物，加已点在纸上的溴酚兰，反复吸打混匀后置于琼脂糖凝胶中进行电泳，电流为10 mA，电源100 V，电泳20 min，紫外灯下观察。用激光光密度扫描仪测定条带的光密度，进行定量分析。�
1.8 TUNEL染色 按照试剂盒说明书操作如下：石蜡切片常规脱蜡至水，蛋白酶K(25μg/m1)37℃ 消化30 min；加新配制的3%H�2O�2溶液室温放置10 min，以封闭内源性过氧化物酶；加TdT酶反应液，湿盒37℃避光反应60 min；加Streptavidin-HRP工作液，37℃避光反应30 min；DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。标记前用DNA酶处理切片做阳性对照，用标记液代替TdT酶反应液做阴性对照。每张切片随机选取10个视野(×400倍)，计数凋亡阳性细胞，以凋亡细胞个数/所有细胞个数反映各组心肌细胞凋亡的情况。1.9 统计学处理 所有数据以±s表示，应用SPSS 11.0统计软件，采用t检验，以P＜0.05为有统计学意义。�
2 结果�
2.1 三组大鼠术后存活情况 缺血预适应组、单纯缺血组和正常组大鼠术后分别存活10只、10只和12只，总存活率为88.9%。�
2.2 三组大鼠SurvivinmRNA的表达水平 见图1。从图中可以看出缺血预适应组SurvivinmRNA的表达水平最高，单纯缺血组表达水平较缺血预适应组降低（P＜0.05）；正常组只有微弱的表达。�
2.3 三组大鼠心肌细胞凋亡率 TUNEL染色示在正常组大鼠心肌中无TUNEL染色阳性细胞，缺血预适应组大鼠的TUNEL染色阳性细胞明显增多，凋亡细胞个数/所有细胞个数为（23.0±5.3）%，单纯缺血组大鼠的TUNEL染色阳性细胞最多，凋亡细胞个数/所有细胞个数为（32.0±2.9）%，与缺血预适应组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。�
图1 三组大鼠心肌中Survivin mRNA的表达
��
3 讨论�
Survivin是1997年由耶鲁大学的Altieri等用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)cDNA在人类基因组库的杂交筛选首先分离出来的�[4]。是近年新发现的凋亡抑制基因，位于染色体17q25上。近来对Survivin的研究局限于肿瘤方面，心肌缺血后能否引起Survivin表达及其在心肌缺血中的作用少有报道。本研究显示，在大鼠心脏单纯缺血和缺血预适应的过程中Survivin的表达都增加，在缺血预适应中增加更为明显。与此同时，缺血预适应组大鼠心肌细胞凋亡较单纯缺血组减少。提示在心脏缺血过程中Survivin具有保护作用。�
随着人们生活水平的提高，心血管疾病已成为现今威胁人类生命健康的最主要杀手之一。心血管疾病最主要的死亡原因是冠心病。心肌持续性缺血可以导致组织损伤以及细胞死亡，而心肌在遭受一次或多次反复的短暂缺血再灌注后，表达出一种对随后而来的一次长时间的严重缺血损伤的抵抗能力的提高，称为缺血预适应，这种现象首次被Murry等�[5]于1986年发现。经过预适应的心肌不但能够缩小心肌梗死的面积，而且可以改善心肌收缩力，保护冠状动脉内皮和心肌细胞的超微结构，降低再灌注导致的心律紊乱的发生率，保护微循环，更快地使心肌从再灌注诱导的心肌顿抑中恢复，是一种内源性自我保护方式。目前认为，磷脂酰肌醇、MAPK、JAK-STAT、NF-κB等信号途径都可能参与缺血预适应，但并不能解释全部现象。因此在本研究中我们探讨Survivin基因在心肌缺血中的作用。�
Survivin基因是一个142氨基酸的蛋白，具有独特的结构和分布而区别于其他凋亡抑制基因，其编码的蛋白是细胞周期G2/M期的重要调节因子，与其他细胞周期G2/M期检测点的调控基因具有协同作用。其抑制细胞凋亡的机制仍不清楚。可能的机制有：(1) Survivin直接抑制Caspase蛋白酶活性而发挥抑制细胞凋亡的作用�[6]。(2)位于Survivin基因-6，-12和-17的GGCGG序列以及-42的ATTTGAA序列调控Survivin基因以细胞周期依赖形式在G2/M期高表达，并与纺锤体γ-微管蛋白结合，稳定微管避免解聚，从而诱导有丝分裂，促进转化细胞的异常增殖而发挥抗凋亡作用。(3) Survivin还参与血管生成过程，血管生成素-1依赖于Survivin的表达上调而起作用。此外，血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等重要的血管生成相关因子可通过Survivin保护微管网络的稳定�[7]。�
总之，在大鼠心脏缺血过程中，Survivin被激活并发挥心脏保护作用。这对于进一步研究心脏缺血中细胞凋亡的发生和发展的机制、改善心脏缺血损伤以及相关药物的开发具有重要的理论及临床意义。�
参 考 文 献�
[1] 郑英梦,施子诺,李志明,等.Survivin与Barrett食管、食管腺癌的关系研究进展[J].实用医学杂志,2007,23(21):3456-3458.�
[2]李梅,陈芸,胡早秀,等.Survivin在乳腺癌中的表达及其临床意义[J].实用医学杂志,2007,23(15):2339-2340.�[3] Hou JQ, He J, Wen DG, et al. Survivin mRNA expression in urine as a biomarker for patients with transitional cell carcinoma of bladder[J]. Chin Med J, 2006,119(13):1118-1120.�[4]Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma[J]. Nat Med,1997,3(8):917-921.�[5]Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J]. Circulation, 1986, 74(5):1124-1136.�[6]Tanaka K, Iwamoto S, Gon G, et al. Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas[J]. Clin Cancer Res,2000,6(1):127-134.�[7]Lee GH, Joo YE, Koh YS, et al. Expression of survivin in gastric cancer and its relationship with tumor angiogenesis[J]. Eur J Gastroenterol Hepatol,2006,18(9):957-963.�
（收稿日期：2008-08-25）
