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【摘要】 目的 探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMCs)氧化损伤的作用及机制。方法 用含不同剂量Hcy（50~1000 μmol/L）的培养基培养VSMCs 24 h后，以分光光度比色法分别测定细胞内丙二醛(MDA)含量和超氧化物酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力的改变。结果 随Hcy浓度增加，VSMCs内MDA的含量明显增加，SOD和CAT的活力也显著升高。Hcy明显促进了VSMCs的氧化。结论 Hcy可直接诱导VSMCs的氧化损伤。
【关键词】 同型半胱氨酸；平滑肌细胞；氧化损伤
同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是近年来确定的致动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)的新的独立的危险因子［1］。研究显示，Hcy含有巯基(-SH)，易发生自身氧化，可生成如超氧化物、过氧化氢和羟自由基等多种强氧化物，启动脂质过氧化链式反应而损伤细胞［2］。Hcy对细胞的氧化作用，以往的研究主要集中在血管内皮细胞上。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs) 也是As发生的主要效应细胞，Hcy对其是否有氧化作用却少见报道。本研究旨在探讨Hcy对VSMCs的氧化作用及机制。
1 材料和方法
1.1 主要实验试剂 DMEM/F12培养基(Gibco)、新生牛血清（杭州四季清）、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、D-Hanks液；同型半胱氨酸 (Sigma)；MDA、SOD、CAT测定试剂盒（南京建成）。
1.2 人VSMCs的体外培养、鉴定与分组 采用组织贴块法培养。取无菌的新鲜的人脐带，剪取脐静脉血管中膜部分并剪成约(0.5 mm×1 mm×1 mm~1.0 mm×1 mm×1 mm大小的血管小块，以每3~5 mm�2块密度均匀种植于培养瓶底。采用DMEM/F12培养液，在37℃、5%CO2培养箱（湿度100%）内静置进行原代培养和传代培养。在倒置显微镜下进行观察，并做α-actin肌动蛋白免疫组化检测。取3~6代细胞用于实验。将细胞分别置于终浓度为0、50、100、200、500、1000 μmol/L Hcy的培养液中孵育24 h，每组重复做5次。
1.3 方法 细胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，2000转/min离心5 min，弃上清液。加入无菌的三蒸水，采用反复冻融法裂解细胞。取上清液按说明书，用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定细胞内丙二醛（MDA）的含量，黄嘌呤氧化法比色测定细胞内超氧化物岐化酶（SOD）的活力，可见光法测定细胞内过氧化氢（CAT）的活力。
1.4 统计学方法 所有数据用（x±s）表示，进行t检验。采用SPSS 13.0软件操作，P15 μmol/L称为高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteine,HHcy)。1969年，McCully发现由于维生素B12的代谢障碍以及胱硫醚-β-合成酶(CβS)缺陷均可导致HHcy和类似As的病变；随后他又通过动物模型证实Hcy在血中蓄积可导致类似As的血管病变。据此，McCully提出HHcy与As有关的假说［3］。近年大量的回顾性、前瞻性和实验性研究已确定，血浆中Hcy水平升高是As发病的一个新的独立的危险因素［4］。
Hcy诱发As的机制相当复杂，目前尚未完全明了，研究认为与氧化损伤、细胞凋亡、炎症反应、凝血纤溶异常等作用有关［5］。其中，氧化损伤作用一直是Hcy引发As的研究重点。Tyagi等研究发现，Hcy在过渡金属离子（Fe3+、Cu2+）的存在下易发生自身氧化，生成多种强氧化产物如超氧化物（O-2•）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（•OH）等，产生氧化应激反应，启动膜脂质过氧化链式反应，降低膜流动性并破坏细胞的完整性，导致细胞功能改变，甚至坏死脱落［6］。高键等研究显示，Hcy可促进内皮细胞内活性氧的生成，使血管内皮细胞处于一种氧化应激状态，进而使血管内皮细胞出现结构和功能上的损害。Hcy通过氧化损伤造成血管内皮细胞损害可能是HHcy导致As的始动环节 ［7］。血管平滑肌细胞（VSMCs）也是As发生的主要效应细胞。VSMCs的增殖、炎症反应、凋亡等病理变化也参与了As病程的发生和发展。本研究结果显示，在Hcy作用下，VSMCs内MDA的含量明显增加，与对照组比较有显著性差异。MDA是脂质过氧化的产物，其含量能直接反映脂质过氧化的速率和强度。说明Hcy也可以直接引发VSMCs发生脂质过氧化反应，从而使VSMCs出现氧化损伤。
本研究结果还显示，在Hcy作用下，VSMCs内SOD和CAT的活力明显升高。SOD和CAT为体内活性氧的清除剂。SOD可催化O-2•生成H2O2,H2O2在CAT作用下生成H2O，从而消除自由基的毒性作用。本研究认为，SOD和CAT活力的升高对Hcy促VSMCs的氧化作用应该是一种代偿反应。Moat等报道，HHcy患者血液中SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性是升高的［8］。本研究发现，小剂量（50 μmol/L）Hcy作用下细胞内主要的抗氧化酶（SOD）的活力就有了明显改变，提示低浓度的Hcy就可促使VSMCs内活性氧生成。而在高浓度（500~1000 μmol/L）Hcy作用下活性氧增多显著，SOD和CAT活力的增高虽可拮抗活性氧的作用，但VSMCs内脂质过氧化反应明显，故MDA含量显著升高，Hcy诱发VSMCs出现了明显的氧化损伤，该作用可能也参与了HHcy致As的发生和发展过程。
参 考 文 献
［1］ Guthikonda S,Haynes WG.Homocysteine:role and implications in atherosclerosis.Cur Athero Rep,2006,8(2):100-106.
［2］ Perez AK,Foncea R,Leighton F.Reactive oxygen species mediates homocysteine-induced mitochondrial biogenesis in human endothelial cells:modulation by antioxidants.Biochemical,2005,338(2):1103-1109.
［3］ Turhan H,Erbay AR.Plasma homocysteine levels in patients with isolated coronary arteryectasia.Int J Cardiol,2005,104(2):158-162.
［4］ Stazka J,Luchowski P,Urbanska EM.Homocysteine,a risk factor for atherosclerosis,biphasically changes the endothelial production of kynurenic acid.Euro Pharm,2005,517(3):217-223.
［5］ LENTZ S R.Mechanism of homocysteine induced atherothrombosis.Thromb,2005,3(8):1646-1654.
［6］ Tyagi N,Sedoris KC,Steed M,at al.Mechanisms of homocysteine-induced oxidative stress. Cir Physiology,2005,289(6):2649-2656.
［7］ 高键,薛安娜.同型半胱氨酸诱导ECV304细胞氧化损伤研究.卫生研究,2003,32(1):20-21.
［8］ Moat SJ,Bonham JR,Cragg RA.Elevated plasma homocysteine elicits an increase in antioxidant enayme activity.Free Rad Res,2000,32(2):171-179.
