【www.zhangdahai.com--护士节演讲稿】
摘要： [目的] 建立快速溶剂萃取（ASE）的前处理方法，并改进纯化步骤。采用该前处理方法将国际二�英标准参考物质进行验证。 [方法] 采用快速溶剂萃取（ASE）法和索氏提取两种提取方法对奶粉样品进行充分萃取，再选用FMS专用净化装置对样品进行纯化，（HRGC/HRMS），采用同位素稀释，以各化合物的同位素标记物为回收率内标，以13C－1,2,3,4-TCDD和13C－1,2,3,7,8,9,-HxCDD为定量内标。用高分辨气相色谱（HRGC）和高分辨双聚焦质谱（HRMS）联用技术进行定性和定量分析。 [结果] 快速溶剂萃取和索氏提取前处理所得的同位素标记化合物平均回收率分别为66.9%和66.5%，测定实际样品的相对标准偏差分别为18.4%和12.3%。 [结论] 通过比较快速溶剂萃取与索氏提取，快速溶剂萃取前处理便捷、时间短、所需溶剂少，回收率和精密度都符合美国EPA1613中的要求，通过用该法测定，结果也接近了欧盟2002/69/EC的规定，即每次测定的同位素标记物回收率不少于60％，如单个化合物的TEQ量小于10％总量TEQ时，不受上述限制。
关键词： 二�英； 快速溶剂萃取； 高分辨气相色谱双聚焦质谱联用
中图分类号：文献标识码： Ａ
二�英（dioxins）是一类三环含氧芳香类有机物，化学名为多氯二苯代二�英（Polychlorinated Dibenzo-p-dioxins,简称PCDD）。中间环为呋喃环的类似化合物多氯二苯代呋喃（Polychlorinated Dibenzo-p-furans，简称PCDF），也有类似的PCDD作用，人们也将其归入二�英。由于取代氯的个数不同，取代位置和立体构象不同，PCDD类共有75个化合物，PCDF类有135个化合物，合计共210个同系物、异构体。二�英是至今最毒的有机污染物，其中2,3,78-四氯代二�英（TCDD）毒性最大，它被国际癌症研究署（IARC）[1]定为第一类致癌剂，是目前极个别的被肯定的环境激素之一。
目前国际上对于食品中二�英前处理方法比较多，提取技术传统的是索氏提取，也有超声提取，柱上直接萃取，快速溶剂萃取等，净化步骤主要以手动为主。我们采用快速溶剂萃取和全自动纯化体统（FMS）连接在一起，提取效率与净化效果完全能达到传统的处理效果，且该方法分析时间快，试剂使用少，效率高。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 有机溶剂均为农残级，或进行蒸馏以去除杂质，无机试剂均为优级纯：正己烷，甲苯， 二氯甲烷，壬烷 ，无水Na�2SO�4（使用前在105℃烘箱中烘烤2h），硫酸（ρ20=1.84g/mL），硅胶（使用前在105℃烘箱中烘烤2h；硫酸硅胶（44%，W/W）：100g硅胶（60-100目））分数次缓慢加入约24mL浓硫酸，充分混匀），氧化铝柱；活性炭柱，硅藻土。
1.1.2 标准物质 二�英混合标准系列，CS1，CS2，CS3，CS4，CS5，溶剂为壬烷 ，13C回收率内标化合物系列：浓度为100ng/mL，13C定量内标化合物系列：1,2,3,4-TCDD（13C12,99％）和1,2,3,7,8,9-HxCDD（13C12,99％），浓度为200ng/mL。
1.1.3 仪器 高分辨率气相色谱/高分辨率质谱联用仪（HRGC/GRMS）（MAT95XP，或同等性能的仪器），色谱柱：DB－5MS （60 m×0.25mm×0.32μm），旋转蒸发器，吹氮浓缩仪，二�英自动纯化装置（FMS），超声波发生器，快速溶剂萃取仪（ASE）（戴安200，或同等性能的仪器）。
1.2 方法
1.2.1 提取 ① 索氏提取方法：准确称取奶粉50g于处理好的提取套筒中，加入13C回收率内标10uL，混匀，平衡30min。装入索式提取器中，向提取器中加入200mL的正己烷+二氯甲烷（1+1），在60℃下回流16h，回流速度控制在每小时约3次。同步做一空白试验。② 快速溶剂萃取（ASE）：提取前将萃取池（33 mL）、接收瓶及管路用正己烷+二氯甲烷（1+1）清洗干净。称取5g硅藻土于50 mL烧杯中，再准确称取奶粉15g于同一烧杯中，用不锈钢棒搅拌混匀，加入13C回收率内标10 uL，混匀，平衡30 min。萃取池底部垫上滤纸，将样品装入萃取池。轻敲萃取池壁，让其填装紧密后，进行萃取。同步做一空白试验。设置快速溶剂萃取参考条件：提取溶剂:正己烷+二氯甲烷（1+1），压力：10.35Pa，温度：125℃，加热时间：5min，静态时间：5min，冲洗体积：60％，氮气吹扫时间：100s，静态循环次数：2
1.2.2 纯化 将提取液于60℃下旋转蒸发至近干。加入10 mL正己烷后继续蒸发至近干，加入50 mL正己烷备用。安装一根玻璃柱，填充物从下往上依次为0.5cm高的无水Na2SO4，25g酸硅胶，0.5 cm高的Na2SO4。（以�克脂肪加10克硫酸硅胶比例）。将备用的提取液通过硫酸硅胶柱，流速为10 mL/min，收集流出液至一梨形瓶中，于60℃下旋转蒸发至约10 mL，待上柱分离。
1.2.3 全自动净化系统（FMS）分离 按仪器使用说明，连接净化色谱柱。将浓缩的提取液转移到FMS净化系统的进样管，运行程序。按图1流程对样品净化、洗脱并收集洗脱液。将收集液并转移至梨形瓶中，于60℃下旋转蒸发至2 mL左右备用。
1.2.4 仪器分析 ①气相参考条件：进样口温度280℃，传输线温度260℃，程序升温110℃维持1.0min，以 30℃/min升至210℃，再以 1.9℃/min升至260℃，维持10min，以20℃/min升至310℃，维持10min。
②质谱条件：分辨率必须在质量数313.48到达10 000以上，PFK（全氟煤油）参考气中一个锁定质量数（lock mass）313.48来进行质量偏移校正。PCDD/Fs选择离子数见表1。
1.2.5 标准曲线 标准溶液测定:按参考程序条件，分别进样CS1到CS5，连续校正5个点。
响应因子计算：校准标准中未标记物的响应因子RRFs
其中:A1s和A2s：校准标准中PCDD/Fs的第一和第二个m/z的面积。A1is和A2is：校准标准中内标记物的第一和第二个m/z的面积。Cs：校准标准中天然物的浓度。Cis：校准标准中内标记物的浓度。
校准标准中内标记物的响应因子RRFis
其中：A1rs和A2rs：定量内标的第一和第二个m/z的面积。A1is和A2is：校正标准内标记物的第一和第二个m/z的面积。Crs：定量内标的浓度。Cis：校准标准中内标记物的浓度。
1.2.6 样品测定 将2 mL备用待测样品在细小氮气流下吹至1 mL以下，转移到微量样品瓶中继续在细小的氮气流下浓缩至近干，边浓缩边加壬烷，直至样品瓶中只有壬烷，最后吹干。加入定量内标化合物（3.4.3）5μL，用壬烷定容至10 μL或20 μL (根据样品中的含量而定)，混匀后进HRGC/HRMS
1μL或 2μL(根据样品中的含量而定)分析。
1.2.7 计算 ①定性：样品中二�英保留时间应与相应13C回收率内标二�英一致。每一化合物选定两个特征离子（见表1），两个离子的丰度比必须满足表2设定的范围。确定峰面积和峰高的比率范围：两个选择离子对应的峰面积和峰高都必须同时满足要求，见表2。
表2理论的离子丰度比和控制限
① 质控限是理论的离子丰度比例的15％；② 不应用净化标准（37Cl4-2,3,7,8-TCDD）；③只用��13C12－HxCDF；④只用13C12－HpCDF同时满足以上两个条件，方可认为被测物质与标准相同。
②定量：每一化合物测定按同位素稀释内标计算，1,2,3,7,8,9－H�XCDD、OCDF和标记化合物中的每一物质的浓度用内标记技术计算。C，pg/g=SUMA×SPAisSUMAis×RRFs×VW
C：待测二�英在样品中之浓度，以(pg/g)计。SUMA：样品峰面积。SPAis：样品中加入3.4.2中��13�C回收率内标物浓度（ng/mL）。SUMAis：样品中加入3.4.2中13C回收率内标物峰面积。��EVR�RRFs：校准标准中未标记物的平均响应因子。V：样品进样前的定容体积（μL）。W：样品重量（g）。
1.2.8计算结果表示
以样品实际重量作为基础计算（pg/g样品） 。以脂肪含量作为基础计算计（pg/g脂肪）（样品中脂肪含量测定参照食品中脂肪的测定方法GB 5009.6-2003）。以毒性当量浓度计算（pgTEQ/g）。根据毒性当量系数(TEF)，见表3。公式如下：
Ci：与下表中对应的二�英在样品中之浓度，以(pg/g)计。TEF：单个二�英化合物其毒性相当于2,3,7,8-TCDD的系数。
表3WHO1997年提供的毒性当量因子[2]
2 结果与讨论
2.1 不同提取方法的比较
二�英的分析是属于超痕量（pg～fg）、多组分（210个同系物、异构体的分离）和复杂的前处理技术，对特异性、选择性和灵敏度的要求相当高，成为当今世界分析领域的难点。奶粉中二�英类化合物的测定方法报道的并不多，但食品中二�英类化合物的测定方法比较多。二�英的分析主要包括样品提取、净化、分离及定量测定。样品的提取目前所采用的手段有索氏提取、快速溶剂萃取、微波溶剂萃取、固液萃取、超声萃取、柱上直接提取、酸介法和碱介法等，提取溶剂也各不相同，主要有正己烷：二氯甲烷（1：1），正己烷：丙酮（1：1），正己烷：乙酸乙酯（1：1），甲苯：甲醇（87：13）等体系，根据不同的样品选择不同的溶剂。本文主要就酸介法和碱介法、索氏提取、快速溶剂萃取、超声萃取进行了研究。
2.1.1 提取方法的研究 表4结果可以验证文献报道的结论[3]，碱介法可能会导致高氯代二�英脱氯转为低氯代二�英，使结果偏高。酸介法杂质干扰比较多，使回收率偏高。
表4酸介法和碱介法的提取效率比较
(以碳13标记化合物的回收率表示)
表5结果显示，索氏提取、快速溶剂提取的回收率比较高，差异无显著性，索氏提取、超声提取的回收率明显低于索氏提取、快速溶剂提取。但三种提取方法的内标记化合物的回收率均在美国环保局EPA Method 1613给出的回收率范围（%）。而欧盟给出的内标记化合物的回收率应大于60％，对于7氯代以后的化合物可以适当放宽。因为美国环保局EPA Method 1613是一个原则性方法，它适用于废水、土壤、底泥等环境样品，而欧盟的方法适用于食品中[4]。基于这个原因，本方法选用索氏提取和快速溶剂提取。
表5 不同提取方式标准参考物的样品回收率（n=3）
2.1.2 不同提取溶剂的比较 主要考虑正己烷和二氯甲烷体系及甲苯体系，正己烷和二氯甲烷体系对脂肪有很好的提取效率，甲苯体系除脂肪外芳香烃类的化合物也有很好的提取效率。我们选用甲苯和正己烷：二氯甲烷体系（1：1）作为提取溶剂进行比较，结果见表6。
表6 不同提取溶剂13C内标记化合物的回收率结果
从以上结果可以看出，低氯代的二�英，提取溶剂为正己烷：二氯甲烷体系（1：1）比提取溶剂为甲苯得到的回收率高。高氯代的二�英，提取溶剂为正己烷：二氯甲烷体系（1：1）比提取溶剂为甲苯得到的回收率低。对于化合物毒性来说，低氯代的二�英远远高于高氯代的二�英，因此，本标准采用正己烷：二氯甲烷体系（1：1）为提取溶剂。
2.1.3 不同的净化方法的比较 净化分离实验可以选用手动装柱人工分析，也可使用目前机械化程度较高的全自动净化体统（FMS）进行分析。考察净化的回收率，分析结果人工分离与仪器都符合要求，而且分离快速方便、安全可靠、重现性好。见表7。
表7两种分析方法的比较
连续测定5次样品，所得的信噪比的3倍为检出限，10倍为定量限。如取50g样品，定容至10μl，样品的最低检出限和定量限见表8。
2.3 精密度和回收率
2.3.1 仪器精密度 最低浓度CS1重复测定5次标记和未标记化合物的相对标准偏差(RSD)分别在0.5％～14％和4.1％～12.6％，平均分别为6.5％和7.8％，符合美国EPA1613[5]中的要求，见表9。
从以上标准参考物CRM的分析结果可以说明，本方法准确度符合欧盟2002/69/EC[6]规定的
