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【摘要】 目的 探讨结核分支杆菌对链霉素(Sm)的耐药分子机制,评估应用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测rpsL、rrs基因突变在结核分支杆菌对链霉素耐药性测定中的应用价值。方法 采用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对55株结核分支杆菌临床分离株(其中药物敏感株23株,耐INH或含耐,INH耐多药株32株)和25例耐SM肺结核患者痰标本的rpsL、rrs基因突变进行检测。结果 以结核分支杆菌H37RV为对照,23株药物敏感株的rpsL、rrs基因突变率分别为4.3%、0。32株耐链霉素分离株中,21株rpsL基因发生突变,突变率为65.6%;4株rrs基因发生突变,突变率为12.5%。25例耐链霉素肺结核患者痰标本中,rpsL基因18例扩增阳性、rrs基因14例扩增阳性,其基因突变检测率分别为50.0%、7.2%。结论 rpsL、rrs基因突变是INH耐药性的重要分子机制。PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术可以快速、准确地检测结核分支杆菌rpsL、rrs基因突变,该技术有望直接用于临床标本耐药性检测。
【关键词】 分支杆菌;结核;药物耐受性;基因
链霉素(Sm)作为最主要的一线抗结核药物之一,但由于单纯化疗和不规律化疗,其耐药情况日益严重,对其耐药性的研究受到重视。[1]有报道认为结核分支杆菌耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16SrRNA的编码基因rrs的缺失和突变所导致 [2]。本院采用采用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测了55株肺结核患者痰标本临床分离株,并对25例结核患者痰标本直接进行rpsL基因、rrs基因突变检测,现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 23例敏感株和32例耐SM或含耐SM的临床分离株来自本所。25例耐SM或含耐SM的肺结核患者痰标本来自本院住院结核患者。按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌并对链霉素耐药。
1.2 方法
1.2.1 细菌DNA的制备[3] 临床分离株DNA用常规酚/氯仿抽提法提取标本中DNA。
1.2.2 PCR扩增 采用25 μl反应体系,4XdNTPs终浓度为0.2 mmol/L,Bio-标记引物终浓度为0.2 μmol/L,扩增程序为:94℃变性I min,58℃退火1 min,72℃延伸I min,循环30次,最后72℃延伸10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测出现267 bp条带。
1.2.3 杂交检测 将点有探针的硝酸纤维素膜装入杂交袋中,加入杂交液放置水浴锅中进行预杂交:45℃×30 min。将Bio-标记引物的PCR扩增阳性产物变性:95 ℃×l0 min,取出迅速放入冰盒中,每毫升杂交液一般加l0 μl变性的扩增产物,放置水浴锅中进行杂交:45℃×30 min。洗膜:洗液1 、45℃× 3 min,洗液2 、45℃×3 min。SA-AP:用1�∶�1000的稀释液(洗液Ⅰ)与膜在37℃作用30 min。洗膜:洗液Ⅰ、45℃× 3 min,洗液Ⅱ、45℃×3 min。显色:每毫升洗液I加入NBT 6.6 μl、BICP 3.3 μl混匀,将配好的显色液加入杂交袋中,闭光37℃显色5 min,观察结果。
2 结果
2.1 PCR扩增,以结核分支杆菌H37RV为对照,23株药物敏感株、32株耐SM分离株rpsL、rrs基因扩增均为阳性;25例耐SM肺结核患者痰标本中rpsL基因18例扩增阳性、rrs基因14例扩增阳性(见表1)。
2.2 应用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术检测rpsL、rrs基因突变结果(见表1、2)。
表1
基因例数 扩增阳性数 基因突变数突变率(%)
rpsL基因25 18950
rrs基因251417.2
表2
对55例临床分离株的检测结果(%)
分离株 例数rpsL基因突变数rr 基因突变数
敏感株23 1(4.3) 0(0)
耐药株 3221(65.6) 4(12.5)
23株药物敏感株的rpsL、rrs基因突变率分别为4.3%、0。32株耐SM分离株中,21株rpsL基因发生突变,突变率为65.6%;4株rrs基因发生突变,突变率为12.5%。耐SM肺结核患者痰标本中,基因突变检测率分别为50.0%、7.2%。
3 讨论
迄今,检测结核杆菌药敏的传统方法仍然是培养法,但由于结核杆菌生长缓慢,使药敏测定结果需要两个月,甚至更长时间,这也是影响结核病化疗效果的原因之一。因此,建立一种新的快速,有效的药敏试验方法对结核病的早期治疗具有重要的意义。有研究表明[4] 结核分支杆菌耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16SrRNA的编码基因rrs的缺失和突变所导致。本实验室前期通过PCR-SSCP方法得出耐链霉素时,rpsL、rrs基因总突变率为72.2%。[4]但PCR-SSCP方法建立在凝胶电泳基础上,难于标准化和质量控制,难以大规模推广。通过对rpsL、rrs基因核心易变区进行DNA序列分析。根据基因突变的中心区域,设计靶基因,制备寡核苷酸探针,点样在杂交膜上,进行PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交。
PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交检测rpsL、rrs基因突变,23株药物敏感株的rpsL、rrs基因突变率分别为4.3%、0。32株耐SM分离株中,21株rpsL基因发生突变,突变率为65.6%;4株rrs基因发生突变,突变率为12.5%。由于有4.3%的敏感株也突变,说明某些耐药菌株的形成可能与rpsL、rrs突变无关。
笔者用PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术直接检测了25例耐SM肺结核患者痰标本,rpsL基因18例扩增阳性、rrs基因18例扩增阳性,其基因突变检测率分别为50.0%、7.2%。低于耐SM临床分离株。这可能是由于痰标本杂质多,同时痰标本的处理和靶DNA浓度对PCR扩增有直接影响。PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏并可以直接检测未经培养的痰标本中结核分支杆菌rpsL、rrs基因突变,为临床检测结核分支杆菌对链霉素耐药性提供了初步依据。
参 考 文 献
[1] Marttuke GJ,Soini H,Vyhneueskiy B.Rapid detection of rifampin- resistant.mycobacterium trberoulosis by Sequencing and line probe assay.Scand J Infect Dis,1998,30(2):129-132.
[2] Morris S,Bai GH,Suffys P,et al.Molecular mech anism of multiple drug resistance in clinical isolates of mycobacterium trberoulosis.JID,1995,171(4):954-957.
[3] Small Scale Mycobacterial hromosomal DNA extraction.MRC,1995.
[4] 张小刚,李书琳,等.结核分支杆菌耐链霉素耐药基因的检测.实用医学杂志,2001,17(10):1006-1007.
