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摘 要目的：检测普陀区中心医院46例乙型肝炎病毒（HBV）患者表面抗原(HBsAg)突变情况,并探讨这些突变是否影响HBsAg的抗原性。方法：从46例HBV患者的血浆中抽提DNA，根据HBsAg的基因序列设计引物，应用聚合酶链反应（PCR）法，扩增46例乙肝病人的HBsAg基因。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物； DNA测序,并与野生型的HBsAg的基因比较,发现突变位点。并用国产的诊断试剂盒检测这些突变体。结果：46例乙肝病人的HBsAg基因的扩增产物经电泳鉴定与预期相同。DNA测序结果表明, 存在基因的突变,其中检测到以前未报道过的突变,为单个碱基替换导致的错义突变；也有部分表现为同义突变，但这些突变体未改变HBsAg的抗原性，25例标本未检测到突变。结论：检测的46例HBV患者的血浆有21例存在突变, 其中1例突变是以前未报道过的突变，这些突变不影响抗原性，25例标本未检测到HBsAg基因突变。
关键词乙型肝炎病毒；乙型肝炎病毒表面抗原； 突变
Abstract Objective：To investigate the mutation of hepatitis B virus surface antigen of 46
patients in Putuo Hospital. Methods：the genomic DNA of 46 patients was prepared for amplification of hepatitis B virus surface antigen gene. the amplified hepatitis B virus surface antigen gene was separated by agrose gel for direct sequencing.Results：Different mutation sites were found in hepatitis B virus surface antigen gene including missense mutation and nosense mutation, some of which were first discovered. However all such mutations did not change the antigencity. No mutation was found in 25 patients. Conclusion：21 patients were found to have mutations in hepatitis B virus surface antigen gene and 25 patients did not have any mutation. One mutation was first reported, and none of mutations changed the antigencity.
Key wordsHepatitis B virus；surface antigen；DNA mutation
世界卫生组织(WHO)报道，超过20亿的人曾经感染过乙肝病毒(HBV)，其中有3．5亿是慢性持续感染，每年超过100万的慢性乙肝携带者死于肝硬化或肝癌[1]。HBV是一种双链环状DNA病毒[2] ，DNA长度约为3．2 kb，其复制是通过逆转录酶进行的[3]，逆转录酶缺乏一定的校正能力，在特异性选择压力下，导致基因序列发生改变，包括碱基的替换、插入和缺失等，这些选择压力包括免疫制剂和核苷类药物等，它能够抑制野生型HBsAg至不可检测的水平。HBV表面抗原(HBsAg)是诊断HBV感染最重要也是最常用的标志物，“a”决定簇的基因区的突变导致其HBsAg不能被一些市售诊断试剂盒中的单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体识别[4]。本研究检测普陀区中心医院46例乙型肝炎病毒（HBV）患者表面抗原(HBsAg)突变情况,并探讨这些突变是否影响HBsAg的抗原性。
1材料和方法
1.1研究对象
2008年4月25日至2008年6月4日我院肝炎门诊收治的30例乙型肝炎患者并经荧光定量PCR检测，DNA拷贝数大于106 。
1.2主要试剂
DNA浓缩液和提取液由中山大学达安基因股份有限公司提供，pfu酶buffer，dNTP等PCR反应试剂购自上海天根生物有限公司，琼脂糖胶购自上海申能博彩生物科技有限公司，乙肝诊断试剂盒购自上海科华生物。
1.3PCR引物的设计
根据HBsAg基因编码区的理论序列设计并由上海生工生物有限公司合成了一套扩增乙肝病毒表面抗原基因的引物即：
S1: 5’-aaGGATCCatggagagcacaacatcaggattcctagg-3’
S2: 5’-ggctcgagTCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGAAAATTGGTAATAGAGG-3’
1.446例HBV患者血浆DNA的抽提
应用静脉采血法采集病人的静脉血液2ml，离心取上层血清； -20 ℃冷冻保存, 备用。取100 ul 血清加入等量DNA浓缩液，振荡器振荡混匀5秒； 12000 rpm 离心10分钟；去上清，沉淀中加入30 ul DNA提取液，振荡器剧烈振荡混匀5～10秒，瞬时离心数秒，100℃恒温处理10分钟；12000 rpm 离心5分钟，备用。
1.5HBsAg基因PCR产物的扩增及测序
以所制备的DNA 为模板,用S1和 S2引物扩增HBsAg基因。扩增体系为50μL，扩增条件为:94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸45s，共32个循环，最后于72℃再延伸10min。PCR产物用10g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。所获阳性PCR片段由上海生物工程有限公司测序。
1.6HBsAg基因突变样本的ELISA检测
取血清100μL，用酶联免疫吸附法( ELISA) 检测HBsAg,。所有操作严格按试剂使用说明书进行。
2结果
2.1HBsAg基因PCR产物的扩增
以抽提的DNA 为模板,用S1和 S2引物扩增HBsAg基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,出现的70Obp左右条带分别为HBsAg基因片段，见图1。
2.246例HBsAg基因PCR产物的序列测定及分析
46例HBsAg基因PCR片段送上海生物工程有限公司测序。经分析发现以下突变，（见表1）。
2.3HBsAg基因突变样本的ELISA检测，
突变样本ELISA检测结果均为阳性，结果（见表2）
3讨论
S基因位于HBV核苷酸第155～833位，编码226个氨基酸的HBV外膜主蛋白，即HBsAg，它是引起机体产生保护性免疫的主要成分。HBsAg有个优势共同抗原表位称?a’决定簇，位于高度保守的124～147位氨基酸亲水区，并以124和127、139和147问的双硫键形成双襻样结构，维持HBsAg的抗原性，期间几个甚至单个氨基酸的变异就足以改变其抗原性[5]。“a”决定簇的基因区的突变导致其HBsAg不能被一些市售诊断试剂盒中的单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体识别，因此提HBsAg试剂盒的临床灵敏度和突变体的识别能力是必要的。HBV突变体的监测是HBsAg检测的一大挑战。目前HBsAg突变体的种类很多，常见的点突变有G145R，T126S，Q129H，M133L，T143L，D144A，T126S + G145R， P142L + G145R， P142S + G145R，D144A+G145R等[6] 。
本研究通过对我院46例乙肝病人表面抗原基因序列的扩增，检测表面抗原基因的突变情况，检测的46例HBV患者的血浆有21例存在突变, 其中1例突变是以前未报道过的突变，这些突变不影响抗原性，25例标本未检测到HBsAg基因突变。
参考文献
[1]SchochetmanG，KuhnsMC．HIV variantsand hepatitis B surface antigen mutants：diagnostic challenges for immunoass-ays[J]．J Med Virol，2006，78(Suppl 1)：s3-6.
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[3]Minami M，Okanoue T，Nak~ima E，et a1．Significance ofPre-S re-gion-defective hepatitis B viru s that emceed during exacerbation for chronic type B hepatitis[J]．Hepatology，1993，17(4)：558-563.
[4]J olivet-Reynaud C，Lsenchal M，O’donnell B，et a1．Localization of hepatitis B surface antigen epitopes present on variants and specifically recognised by anti-hepatitis B surface antigen m0nocl0nal antibodies[J]，JMed Virol，2001，65(2)：241-249.
[5]Paul F．Detectiong hepatitis B surface antigen mutants[J]．Emerg InfectDis，2006，12(2)：198-203.
[6]Ni F，Fang D，Gan R，et a1．A new immune escape mut~t of hepatitis B virus with an Asp to Ala substitution in aa144 of the envelop major protein[J]．Res Virol，1995，146(6)：397-407.
作者简介：
康向东男（1959-），博士，主任技师，主要从事肿瘤、单抗、自身免疫病病因及发病机制研究。
