【www.zhangdahai.com--护士节征文稿】
【摘要】目的找到一种适合修复周围神经缺损要求的雪旺氏细胞培养方法｡方法分别采用三种不同方法进行雪旺氏细胞培养,并比较各种方法培养的雪旺氏细胞的生长情况及纯度｡结果先用酶消化后组织块贴壁培养的的方法,雪旺氏细胞“爬出”速度较直接组织贴壁培养方法快,但较直接酶消化法慢,而纯度均较其他二种方法高｡结论先用酶消化组织块,后再将组织块贴壁培养的方法
【关键词】雪旺氏细胞;体外培养;新方法
雪旺氏细胞是周围神经的一种胶质细胞,是周围神经的髓鞘细胞,排列成串,一个一个的包裹着周围神经轴突,其外面包有一层基膜｡在有髓神经纤维中,雪旺氏细胞形成神经的髓鞘,是周围神经系统的髓鞘形成细胞,在周围神经再生中起重要的作用,对于周围神经缺损修复有重要的意义｡故体外培养雪旺氏细胞是神经生物学研究的一个重要方面｡本文作者通过对三种不同方法培养出雪旺氏细胞的速度和纯度进行比较,找到一种简易的､稳定的､受外界影响小的､高纯度､大数量的雪旺氏细胞培养法｡�
1材料与方法�
1.1设备及试剂普通显微镜､显微手术器械､CO�2培养箱(德国产)以及普通细胞培养器材一套,直径50mm一次性培养皿(德国生产)若干个,D-Hank,s液,含10%胎牛血清(杭州四季青产)的F��12�(Hyclone产 )+DMEM(Gibco产)培养液(F12�+DMED=1∶1),IV型胶原酶(Gibco产),胰蛋白酶(Sigma公司),EDTA(华美公司)｡�
1.2雪旺氏细胞的取材注射过量的水合氯醛处死出生3d的SD乳鼠6只,浸于75%医用酒精消毒3min,取出用无菌D-Hank,s液反复冲洗4次,在无菌条件下取出坐骨神和臂层神经,解剖显微镜下仔细剥除神经基膜,再用D-Hank,s液反复冲洗3次,用显微手术剪,将组织块剪成约2mm长的组织碎块,再用D-Hank,s液反复冲洗3次,吸干,置于一次性离心管中｡�
1.3雪旺氏细胞的培养�
1.3.1酶消化､组织块贴壁培养往上述离心管中加入等体积0.5%的胰蛋白酶和0.06%IV型胶原,使二者的总体积约为组织块体积的4倍｡将离心管置于37℃的恒温水浴锅中
消化40min,每隔5min振荡一次｡取出离心管,往离心管中加入含10%胎牛血清的F12+DMEM(1∶1)培养液3ml终止消化｡以1 000转/分离心5min,吸去液体｡用D-Hank,s液反复冲洗离心管中的组织块,离心吸干后再冲洗,共4次｡将冲洗后的组织贴到一次性培养皿中,使每块组织块的距离为3mm｡往培养皿中加入少许的上述培养液,置于含5%CO�2､37℃的CO�2培养箱中培养4h,固定组织块｡取出再加入更多的培养液,使培养液浸满组织为宜,放回培养箱中继续培养｡
1.3.2直接组织块贴壁法将从SD乳鼠取出来的去基膜神经组织切成3mm长碎块,用D-Hank,s液反复冲洗3次后贴到涂有多聚赖氨酸的一次性培养皿上,使每块组织块的距离为4mm｡置CO�2培养箱内,3h后加入含10%胎牛血清的F��12�+DMEM(1∶1)培养液,继续培养｡�
1.3.3酶消化细胞悬浊液法将从SD乳鼠取出来的去基膜神经组织切成3mm长碎块,用D-Hank,s液反复冲洗3次后,吸干,置于一次性离心管中｡往离心管中加入等体积0.5%的胰蛋白酶和0.06%IV型胶原,使二者的总体积约为组织块体积的4倍｡将离心管置于37℃的恒温振荡器中(振荡频率为20次/min)消化3h｡取出离心管,往离心管中加入含10%胎牛血清的F12+DMEM(1:1)培养液3ml终止消化｡用200目滤筛滤去残余的组织块,将过滤液以1 000转/分离心5min,吸去液体｡再用D-Hank,s液反复冲洗2次,加入培养液制细胞悬浊液,将细胞悬浊液加入培养皿,放到CO�2培养箱中培养｡�
2实验结果�
先用酶消化后组织块贴壁培养的的方法,雪旺氏细胞“爬出”速度较直接组织贴壁培养方法快,但数量较直接酶消化法少,而纯度均较其他二种方法高｡
3讨论�
3.1体外培养雪旺氏细胞在组织工程化周围神经缺损修复中的重要性｡ 近几年随着现代工业､建筑业和高速交通的快速发展,周围神经缺损的病人日渐增多｡而到目前为止最理想也是唯一的修复方法仍然是自体神经移植｡但这种方法的缺点是牺牲供区的神经支配,造成新的创伤｡因此找到一种两全其美的方法一直是许多学者所追求的｡近几年随着组织工程学的发展,人们利用组织工程的方法,将体外培养､纯化､扩增的雪旺氏细胞接种于多支架上,经进一步培养,制成了周围神经的替代物并回植于神经缺损处,修复周围神经缺损取得了一定的成果｡但该方法的前提是必须体外培养出高纯度､足够量的雪旺氏细胞｡故如何体外培养和纯化出足够量的雪旺氏细胞是进行组织工程方法修复周围神经缺损的重要方面｡�
3.2先用酶消化后组织块贴壁培养的的方法较其他方法的优点｡ 雪旺氏细胞是包裹在周围神经纤维轴突的外面,其外面包有内膜､束膜和外膜[1]｡在解剖微镜下要剥除雪旺氏细胞外面的各层膜,理论上是可以的,但实际操作难度很大,花费时间较长,若剥不干净,培养出来的细胞中成纤维细胞含量较多;若剥彻底,雪旺氏细胞易受伤和丢失较多｡传统雪旺氏细胞培养的方法有组织贴壁培养法和酶消化培养法｡组织块贴壁方法培养,雪旺氏细胞从组织“爬出”时间较长,细胞产量小,且“爬出”的细胞中成纤维细胞的含量较高｡酶消化法培养出来的雪旺氏细胞数量相对较多,但细胞中同样存在大量的成纤维细胞｡以上两种方法培养出来的细胞纯度低,很难满足实验的要求,需进一步纯化｡以往采用了抗有丝分裂法､酶溶解法､轴突诱导增殖法和免疫选择法等也可以得到高纯度的雪旺细胞,但操作复杂,受实验因素干扰多[2]｡很可能对实验因素作用的特异性和实验结果的可靠性造成不可知的影响｡先用酶消化后组织块贴壁培养的的方法,先用消化酶将内膜､束膜､外膜大部分消化去,然后再将组织贴壁培养,可见雪旺氏细胞从组织中“爬出”的速度较快,纯度较高｡这样可以避免花费大量的时间和精力去剥掉雪旺氏外面的膜结构,减少对雪旺氏细胞的损害,使培养出来的雪旺氏细胞受实验的因素影响也较小,有利于进一步开展研究｡故本方法简便可行值得进一步推广｡
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