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【摘要】目的：研究药用植物续随子地上部分乙醇提取物的正己烷部分的抗肿瘤活性部位。方法：化学分离与体外抗肿瘤活性筛选相结合，快速寻找到活性部位。化学分离的手段包括乙醇提取、不同极性溶剂萃取、硅胶柱色谱分离、MTT法测定不同流份的抗肿瘤活性。结果：续随子地上部分乙醇提取物的正己烷部分经过硅胶柱色谱粗分离得到的流份Fr. 11-13、Fr. 46-54、Fr. 73-86、Fr. 87-92具有较强的体外抗肿瘤活性，对肺癌细胞A549的IC50值分别是19.74 ± 3.52、33.11 ± 4.61、26.45 ± 1.77、24.60 ± 2.96 μg/ml。结论：续随子地上部分乙醇提取物的正己烷部分具有进一步研究的价值，化学分离与体外抗肿瘤活性筛选相结合有助于抗肿瘤活性成分的分离。
【关键词】续随子，正己烷部分，抗肿瘤活性
千金子又名续随子(《开宝本草》)，也称菩萨豆(《日华子本草》)，拒冬实(《本草图经》)、拒冬子(《本草汇言》)、联步(《斗门方》)，滩板救(《湖南药物志》)、看园老(《贵州草药》)、千两金、小巴豆、打鼓子等，为大戟科植物续随子Euphorbia lathyris L.的干燥成熟种子，始载于宋代《开宝本草》。千金子是传统中药，收载于我国药典，可用于治疗恶性肿瘤 [1]。国内外已有不少文献报道了千金子的抗肿瘤活性成分及作用机制 [2-4]。续随子地上部分（不含种子）的抗肿瘤活性成分研究则鲜见，本研究采用乙醇提取的方法，以正己烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取，重点研究了续随子地上部分乙醇提取物的正己烷部分的抗肿瘤活性部位，为下一步的分离提供依据。
1 仪器与材料
1.1 药材与细胞
本实验所用续随子地上部分购于河北安国药材市场，标本存放于广州医学院药学系。人肺癌细胞A549培养在含10％小牛血清、青霉素 (100 IU/ml ) 及链霉素 (100 IU/ml ) 的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱中 [5]。
1.2 化学与生物试剂
二甲基亚砜、正己烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（分析纯，天津市广成化学试剂有限公司生产），胎牛血清购自Gibco公司；柱色谱硅胶200-300目、薄层色谱硅胶 GF254（市售，化学纯,，青岛海洋化工有限公司生产）；磷钼酸（市售，分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司生产）；3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）。
1.3仪器RE-52AA旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技有限制造）、SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）、DLSB-5/10低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司生产）、YH系列电热套5000ml（江苏近湖镇教学仪器厂生产），ZF-5型手提式紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限制造）；Model 550 酶标仪(Bio-Rad)
2 实验与结果
2.1千金子乙醇提取物的制备
将续随子的干燥地上部分（25kg）用药材粉碎机粉碎，室温浸泡过夜，95%乙醇加热回流提取3次，每次3h。将所得提取液进行合并，减压旋转蒸发仪浓缩，得到棕黑色总提取物，具体流程见图1：
图1. 续随子地上部分的乙醇提取流程
2.2不同萃取部分的制备
将浓缩所得总提取物1100g加水混悬至2L，倒入5L分液漏斗中，水层以等量的正己烷萃取，重复3次，上层为正己烷萃取相，下层为水层。正己烷萃取相经减压旋转蒸发仪浓缩至浸膏状，得到乙酸乙酯层提取物(600g)。余下水层以2L乙酸乙酯萃取，重复3次，上层为乙酸乙酯萃取相，下层为水层。乙酸乙酯萃取相经减压旋转蒸发仪浓缩至浸膏状，得到乙酸乙酯层提取物(280g)。余下水层以2L正丁醇萃取，重复3次，上层为正丁醇萃取相，下层为水层，分别浓缩后，得到正丁醇部分80g，水部分140g，萃取流程图见图2。
图2. 千金子乙醇提取物的萃取流程
2.3正己烷部分的粗分离
硅胶柱色谱分离：湿法装柱，干法拌样，正己烷萃取浓缩液用适量乙酸乙酯稀释，用500g色谱硅胶（200-300目）拌样，装于柱顶，进行洗脱。
本实验用石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-甲醇进行梯度洗脱，洗脱液I：石油醚 20000ml；II：石油醚-乙酸乙酯（10：1） 20000ml；III：石油醚-乙酸乙酯（5：1） 15000ml；IV：乙酸乙酯 15000ml；V：乙酸乙酯-甲醇（3：1）10000ml。
将洗脱液每500ml作为一个组分进行收集，再真空浓缩，薄层色谱检识，展开剂为石油醚-乙酸乙酯（10：1～2：1），于紫外分析仪下检测，并用5％浓硫酸-乙醇溶液或5%磷钼酸-乙醇溶液显色，合并相近组分结果如下：Fr.1-3、Fr.4-7、Fr.8-10、Fr. 11-13、Fr. 14-16、Fr. 17-38、Fr. 39-45、Fr. 46-54、Fr. 55-62、Fr. 63-72、Fr. 73-86、Fr. 87-92、Fr. 93-104、Fr. 105-117、Fr. 118-129。
2.4正己烷部分粗分离组分的抗肿瘤活性筛选
取对数生长期A549细胞分别以1.5×104个细胞/ml的浓度接种于96孔培养板，每孔体积为190 μl。培养24h待细胞贴壁后，分别加入10 μl不同浓度的受试化合物，同时设空白对照组和生理盐水对照组，每组设4个平行孔。培养68h后加入MTT，继续培养4h，倾去培养液，每孔加入100 μl二甲基亚枫，待完全溶解显色后，用酶标仪540/655 nm双波长测定，以Bliss法计算细胞生长抑制50％时的药物浓度，即IC50值。细胞存活率=(实验组平均OD值-空白孔OD) / (对照组平均OD值-空白孔OD)×100% [6]。活性筛选结果见表1。
3讨论与结论
恶性肿瘤对人类的危害巨大，是仅次于心血管疾病的第二杀手。不断寻找新型抗肿瘤药物是治疗肿瘤的有效策略。我国传统中药是抗肿瘤新药研究的重要宝藏。千金子是大戟属植物续随子Euphorbia lathyris L.的种子，可用于治疗恶性肿瘤，文献报道表明，千金子所含的二萜类化合物具有一定的抗肿瘤活性 [5]。续随子地上部分的抗肿瘤活性成分的研究较少报道。
本文采用化学分离与抗肿瘤活性筛选相结合的办法，初步发现续随子地上部分乙醇提取物的正己烷部分的流份Fr. 11-13、Fr. 46-54、Fr. 73-86、Fr. 87-92具有较强的体外抗肿瘤活性，对肺癌细胞A549的IC50值分别是19.74 ± 3.52、33.11 ± 4.61、26.45 ± 1.77、24.60 ± 2.96 μg/ml。这些研究结果为进一步的化学分离与抗肿瘤机制研究打下了良好的基础。在后续的研究中，我们将继续将化学分离与抗肿瘤活性筛选相结合，以快速的寻找到抗肿瘤活性成分。
参考文献
[1] 李同琴，郭秋红，田质芬。大戟科植物药用历史沿革及价值的探讨[J]。中国药学刊,2003,21 (8) : 1349-50
[2] 史海明，闵知大，屠鹏飞，李晓波。中国大戟属植物中二萜成分的化学及生物活性[J]。化学进展，2008, 20(2/3)：375-385。
[3] Shi QW, Su XH, Kiyota H. Chemical and pharmacological research of the plants in genus Euphorbia[J]. Chemical Reviews. 2008, 108(10): 4295-4327.
[4] Zhang JY, Liang YJ, Chen HB, Zheng LS, Mi YJ, Wang F, Zhao XQ, Wang XK, Zhang H and Fu LW. Structure Identification of Euphorbia Factor L3 and Its Induction of Apoptosis through the Mitochondrial Pathway[J]. Molecules. 2011, 16(4): 3222-3231.
[5] Zhang JY, Mi YJ, Chen SP, Wang F, Liang YJ, Zheng LS, Shi CJ, Tao LY, Chen LM, Chen HB, Fu LW. Euphorbia factor L1 reverses ABCB1-mediated multidrug resistance involving interaction with ABCB1 independent of ABCB1 downregualtion[J]. Journal of Cellular Biochemistry. 2011, 112(4):1076-83.
[6] Zhang JY, Tao LY, Liang YJ, Yan YY, Dai CL, Xia XK, She ZG, Lin YC, Fu LW. Secalonic acid D induced leukemia cell apoptosis and cell cycle arrest of G1 with involvement of GSK-3beta/beta-catenin/c-Myc pathway[J]. Cell Cycle. 2009, 8(15): 2444-2450.
通讯作者：张建业，肿瘤学博士，广州医学院药学系
表1 正己烷部分粗分离组分的抗肿瘤活性筛选结果
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
