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【中图分类号】 R318 【文献标识码】 A 【文章编号】1185-1672(2009)- 04-0311-03 摘要 目的探讨在50例胶质瘤中57kip、27kip1二者与胶质瘤发生发展的关系以及二者之 间相关性。方法 应用免疫组织化学技术检测50 例不同病理分级脑胶质 瘤中p57kip2和p27kip1蛋白表达,10正常脑组织为正常对照。结果p57kip2 、p27� kip1在胶质瘤蛋白阳性表达 率分别为34%(17/50)、 38%(19/50)，均低于正常脑组织70%(7/10)、 80%(8/10)。在胶质瘤 Ⅰ～Ⅳ级的蛋白阳性表达率,差异均具有显著性意义。结论 p57kip2、p27kip1 在胶质瘤的 发生、发展过程中起重要的作用，其表达水平与胶质瘤的分化程度密切相关，联合检测p57 kip2、p27kip1是判断胶质瘤恶性程度的重要参考指标
关键词 胶质瘤；p57kip2；p27kip1；免疫组化
细胞周期调控机制的破坏，导致细胞的失控生长。细胞周期调控机制决定着细胞是否、何 时 开始生长、分裂或死亡。这个精密的程序在相关基因的控制下，依据一定的规则和节奏运行 着，调控细胞的生长、分裂和死亡。如果在胚胎细胞中，细胞周期不能运行，结果是死亡; 而一旦在成熟细胞，细胞周期不能运行，则结果是肿瘤发生。目前有关p57kip2, p27kip1在 肿瘤增殖调控中作用的研究才刚刚起步，对于p57kip2, p27kip1在脑胶质瘤中 的表达机制以 及与胶质瘤细胞增殖活性的关系，尚未完全阐明，探讨p57kip2和p27kip1在胶 质瘤中的表达 情况及其与胶质瘤细胞增殖活性的关系，旨在进一步研究p57kip2和p27kip1在 脑胶质瘤发生、发展及肿瘤增殖调控中的作用。
1 资料与方法
1.1 组织标本 收集胶质瘤病理石蜡标本50例。男患者28例，女患者22 例，年龄19～74岁 之间，平均46.14岁。根据2000年修改的WHO神经系统肿瘤分类标准，对所有胶质瘤进行组织 学分类和分级后，划分为低度恶性(I、II级)和高度恶性(III 、Ⅳ级)两种。低度恶性I级12 例、II级15例，高度恶性III级13例、Ⅳ级10例。所有患者术前均未接受过放疗及化疗。对 照组10例脑组织，其中正常脑组织无胶质细胞增生，无细胞坏死和水肿。各组在年龄、性别 无统计学差异。
1.2 试剂鼠抗人p57kip2单克隆抗体，鼠抗人 p27kip1单克隆抗体，s-p免疫组化染色试剂 盒,DAB显色试剂盒均购于福建迈新生物技术开发有限公司。3％H2O2、0.01M磷酸盐缓冲 液(PBS)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA),二甲基联苯胺(DAB)及苏木素。
1.3 方法 主要步骤 连续切片厚4μm ,脱蜡后经1%H2O2 10 min , 以阻断内源性过氧化物 酶。0.01MpH 6.0 枸橼酸缓冲液,微波处理。10%小牛血清封闭, 切片中分别加入p57kip2, p27kip1抗体, 4 ℃过夜。加入二抗1∶250 及SP/ HRP , 1∶200 。DAB显色， 苏木素衬染， 树胶封片。脑组织为正常对照, 以PBS 代替一抗作为阴性对照。
1.4 统计学分析 运用SPSS11.5统计软件进行分析，应 用x2检验和校正x2检验，Spersman等级相关分析。
2 结果
2.1 p57kip2在脑胶质瘤中的表达情况 在50例 脑胶质瘤患者中，p57kip2蛋白阳性率为3 4% (17/50)，阳性反应细胞为细胞核和(或)胞浆内呈黄色或棕黄色的染色颗粒(表1)。 10例 正常脑组织中(见表1)，p57kip2蛋白阳性率为70% ( 7/10 )，两者比较差异有显著性 (Pkip2蛋白阳性表达率低于低度恶性组(Ⅰ～Ⅱ) ，二者差异有显著性(Pkip1蛋白阳性率 为38% (19/50 )，阳性反应细胞为细胞核和(或)胞浆内呈黄色或棕黄色的染色颗粒(表2)。1 0例正常脑组织中(见表2)，p27kip1蛋白阳性率为70% ( 7/10 )，两者比较差异有显 著性(Pkip1蛋白阳性表达率低于低度 恶性组(Ⅰ～Ⅱ)，二者差异有显著性(Pkip1蛋白的表达�2= 11.76 ，Pkip1蛋白在低度恶性组 (Ⅰ～Ⅱ)与高度恶性组 (Ⅲ～Ⅳ)的表达�2=3.59, P kip2蛋白与p27kip1蛋白表达的关系 胶质瘤组织中p57kip2蛋白表达与p27kip1 蛋白表达情况(见表3)。400倍显微镜下每张载玻片计数500个细胞.依据染色阳性细胞所占细 胞总数的百分率判定表达的阳阴性。阳性细胞>10%为阳性(+-+++)其中10%～25%为(+)26% ～50%为(++)>50%为(+++)。无阳性细胞或阳性细胞kip2定位于染色体11p11.5，编码的蛋白P57kip2分子 量为57KD，有 三个功能区，功能区1与P21和P27极相似，为CDK活性抑制区。p57kip2对细胞的生长 有着极 其重要的调控作用，主要通过抑制CDK复合物的功能来实现其作用。它主要抑制Cyclin E-CD K2, Cyclin A-CDK2 和CyclinD-CDK2等Gl期和S期激酶复合物使细胞不能通过Gl期。一方面 通过氨基端与Cyclin E- CDK2, CyclinA- CDK 2和Cyclin D- CDK 2等激酶复合物结合，抑 制其对Rb蛋白的磷酸化,E2F不能释放而使细胞停滞于G1期;另一方面，通过抑制CDK2 Thr160 的磷酸化而抑制CDK2的激活，还可通过梭基端与PCNA的结合，抑制细胞的增生［1］ 。p57kip2负性调节细胞增生的生物学功能，提示它可能具有肿瘤抑制作用，而成为 一个候选的肿瘤抑制基因。p57kip2基因缺失的小鼠呈现过度增长，肿瘤生长倾向和 高频率的肿瘤转向，这说明p57kip2对抑制肿瘤的发生、发展有重要作用［2］ 。Ito等［3］ 研究了p57kip2在37例肝外胆管癌(BDC)及28例肝内胆管癌(CCC) 中的表达时发现二者的标记指数（Labeling Index, LI）分别为60.8±7.9,58.6±8.6，显 著底于正常胆管上皮，二者有统计学差异(Pkip2低LI与肿瘤生物学侵袭性如低分化，淋巴结 转移有关。Nakai等［4］应用免疫组化测定59例肝细胞性肝癌p57kip2的表达 常丢失，特别在中低分化者中。研究p57kip2在脑胶质瘤中表达及其与肿瘤细胞分化 的关系是本课题研究的主要目的之一。
在此项研究发现，在50例脑胶质瘤患者中，p57kip2蛋白阳性率为34% (17/50) ，10 例正常脑组织p57kip2蛋白阳性率为70% (7/10)，两者比较差异有显著性(Pkip2蛋白表达阳性率高于分化较低( Ⅲ～Ⅳ)的脑胶质瘤组(Pkip2蛋白表达强度随着恶性程度的增高而降低。以上研究结果表 明，高 度恶性脑胶质瘤中p57kip2蛋白的低水平表达导致其负性调节细胞增生的生物学功能 下降或 丧失，从而引起肿瘤细胞的增殖失去抑制，最终导致脑胶质瘤的发生及恶性进展。提示p57 kip2蛋白的表达下调在脑胶质瘤的发生及恶性进展过程中起重要作用。另有研究表明 人类肿瘤中p57基因的突变是很罕见的，因此可以推断，p57kip2蛋白在肿瘤组织中的 表达下调，其主要原因为它基因表达水平的改变［5］。研究表明，p57kip2蛋 白的表达水平受多种机制的调控，如泛素化降解、抗增殖信号因子、细胞因子以及接触性抑 制等［6］。在某些肿瘤中存在p57kip2基因印记缺失(loss of imprinting, L OI)或杂合型丢失(loss of heterozygosity, LOH )［7］。Polyak等［8］ 在研究细胞间接触抑制和 TGF-β诱导细胞生长停滞于G1期的机制时 ，从静息 的细胞抽提物中发现一个27kD的热稳定蛋白质,称之为p27kip1，它具有抑制cyclinE- CDK2复 合物的活性，对细胞周期具负调控作用。Pietenpol等［9］ 利用人p27 cDNA作探针 筛选得到 定位于人染色体12p13的p27基因,它包含2个外显子和2个内含子。人p27 cDNA长594bp.含198 个氨基酸，是高度保守的蛋白分子、在人、鼠、貂中p27kip1的氨基酸序列具有90%的 同源性 。p27kip1主要与cyclin结合而发挥对cyclin- CDK的抑制作用。p27kip1对CDK 的抑制作用有 两方面，一方面p27kip1能抑制己结合到cyclin 并被激活的CDK活性;另一方面p27 � kip1也可以抑制CDK的激活过程.最终抑制细胞周期G1�S的转变。Ellis等［10］在研究一组缺失了p27基因小鼠的食管粘膜上皮后发现其食管癌的发生率明显高于缺失者. 二者比较差异显著。Y ang等［11］ 将人类p27基因作为抗癌基因表达于HFR2基因过 表达的细胞中，发现可 以抑制该 基因引起的细胞恶性转化。Hayashi等研究一组非小细胞肺癌后认为p27基因 在肺腺癌 的进展中扮演着重要角色。这些研究表明, p27基因成为抑癌基因的新成员,是一个肿瘤抑制 因子。本研究发现，在50例脑胶质瘤患者中，p27kip1蛋白阳性率为38%(19/50) 。10例正常脑组织p27kip1蛋白阳性率为80%（8/10)，两者比较差异有显著性(Pkip1蛋白阳性表达率低于低度恶性组(Ⅰ ～Ⅱ)，二者差异有显著性(Pkip1在23例Ⅱ和Ⅲ级少突胶质瘤中的表达, 发现 p27kip1与病 理级别呈负相关。Nakasu等证实，脑胶质瘤细 胞p27kip1表达下降的同时，总伴随蛋白酶降解活性的上升，而蛋白酶抑制剂可缓解p27kip1的降解，抑制p27kip1表达水平的下调。由此可以推论，脑胶质瘤细胞 中p27kip1表达的改变主要取决于翻译后的代谢调节，而不是基因突变。p27kip1 与肿瘤的相关性不表现在基因缺失或突变上，而是以其蛋白水平这样一种化学剂量关系起 作用，与脑胶质瘤的发生和恶性进展有密切的关系。
总之，研究表明p57kip2蛋白和p27kip1蛋白的表达与胶质瘤的分化程度有关 。在脑胶质瘤 中p57kip2蛋白和p27kip1蛋白的表达下调，提示二者在G1/S期可能通过一定机 制协同调节细 胞周期进程，导致细胞活性的改变，促进肿瘤的发生和恶性进展。深入研究p57kip2 蛋白与p27kip1蛋白的作用机制，将为脑胶质瘤的治疗提供新的思路。
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(收稿日期 2009-01-21)(编辑 刘建勋)
