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[摘要] 目的：采用双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案快速筛查检测公共场所从业人员肠道传染病菌，并与经典的培养法比较，探讨该方法的可行性。方法：随机采集5 000份从业人员的肛拭子标本，分别采用双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案和“金标准”培养法同时检测肠道沙门和志贺菌，比较两种方法检测结果之间的差异。结果：双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案的灵敏度为100%，特异性为99.64%，同培养法相比，具有省时、省力、操作安全、成本接近等优点，两种检测方法的阳性率无显著性差异。结论：提示双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案可做为从业人员肠道传染病菌快速筛查的技术方法。
[关键词] 双色实时荧光PCR；标本混合检测方案；特异度；灵敏度；阳性率
[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B[文章编号] 1674-4721（2010）11（a）-078-03
Rapid detection of intestinal pathogenes by real time PCR method combined with sample pooling process
LI Yiqiang, YANG Furong, KONG Minling, QIN Xiaojie, MAI Jiemei
(Center for Disease Control and Prevention of PanYu District in Guang Zhou City, Guangdong Province, Guang Zhou 511400, China)
[Abstract] Objective: The real time PCR method combined with sample pooling process was used to detect the intestinal pathogen in public sanitation related employees, its potential application was evaluated by compared with classical culture method. Methods: 5 000 anal swab specimens from public sanitation related employee were randomly collected, the samples were detected simultaneously for Salmonella and Shigella by real time PCR method combined with sample pooling process and "gold standard" culture method, the sensitivity and specificity of two were also evaluated. Results: The sensitivity and specificity of real time PCR method were 100% and 99.64% respectively, the positive rate showed no significant differences between two methods, however, the real time PCR method was faster, more secure and less laborious consuming compared with culture method. Conclusion: Real time PCR method combined with sample pooling process can be applied on the routine detection of intestinal pathogen in public sanitation related employee.
[Key words] Real time PCR; Sample pooling; Sensitivity; Specificity; Positive rate
目前检测从业人员肠道传染病菌的指标菌沙门氏菌和志贺氏菌的传统国家标准检验方法“金标准”培养法，其优点在于特异性强，但缺点是检测时间长，操作繁琐，灵敏度低，要求检验人员有丰富的工作经验。传统国家标准检验方法须5～7 d才能检出病原体，存在检验时间较长的问题。双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案，是将双色实时荧光PCR方法技术[1]和标本混合检测方案技术[2]这两种现代先进技术结合在一起的一种新的技术方法。为探讨双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案检测从业人员肠道传染病菌的可行性，随机采集5 000份从业人员的肛拭子标本，采用双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案和“金标准”培养法同时检测肠道传染病菌，比较两种方法检测结果之间的差异，结果如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机抽取2009年6月～11月公共场所从业人员的5 000份肛拭子标本。
1.2 试剂
深圳生科源技术有限公司生产的沙门氏菌和志贺氏菌双色实时荧光PCR检测试剂、含营养肉汤增菌液的一次性多功能采样器。北京陆桥技术有限责任公司生产的各种增菌液、选择性培养基、生化反应管，生物梅里埃公司生产的ID32E生化诊断试剂条。
1.3 仪器
杭州博日科技有限公司生产荧光定量PCR仪，生物梅里埃公司生产的半自动细菌生化鉴定仪，杭州雪中炭恒温技术有限公司生产的电热恒温培养箱，日本奥林巴斯公司生产的生物显微镜。
1.4 方法
1.4.1 采样使用含有营养肉汤增菌液的多功能采样器，随机采集健康体检从业人员的肛拭子标本5 000份。
1.4.2 使用双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案进行检测将标本37℃预增菌3 h后，混匀，先将每10份标本各滴出0.1 ml于Pooling混合管中，混合成1 ml，做为1个新的标本，充分振摇均匀后，在冷冻离心机中离心5 min后弃去上清，留下沉淀，将DNA提取液在微型离心机中2000 rpm离心10 s，在每管标本沉淀中加入50 μl DNA提取液，密封后用手指弹离心管底部将沉淀悬浮，置干式恒温仪中100℃处理5 min，取出冷却至室温，再在冷冻离心机中12 000 rpm离心5 min，制成标本模板。取加有沙门菌和志贺菌双色荧光检测试剂的PCR八联反应管，2000 rpm离心10 s。第1孔不加任何物质，做为空白对照，第2、3孔分别加入阴、阳性对照各5 μl，从第4孔开始每孔加入标本模板的上清液各5 μl，盖好反应管盖子，振荡混匀后再在微型离心机中2 000 rpm离心10 s。记录标本模板加样顺序后，将加有标本的PCR八联反应管放入荧光定量PCR仪中，进行检测。将检测阳性的10份原始标本再用培养法进行进行菌属和型别的鉴定，鉴定出沙门菌或志贺菌菌属和型别的标本才做为PCR检测阳性标本。检测过程质量控制：PCR检测过程均严格按照《临床基因扩增检验实验室工作规范》和PCR检测操作规程[3]的要求进行操作。防止所有引起假阳性、假阴性的因素出现，在专用的PCR实验室内，按试剂贮存与准备区、标本处理区、扩增反应与分析区的分区流程单一方向规范操作，防止出现交叉污染。严格按照试剂盒的说明书结合临床结果来判定检验结果。
1.4.3 使用培养法对逐份样品进行检测将每份肛拭子标本37℃预增菌6 h后，分别分装于SC和GN增菌液中，各增菌18 h后，SC增菌液转种BS琼脂平板和HE琼脂平板，GN增菌液转种HE琼脂平板和EMB琼脂平板，将上述平板培养18 h后，挑取各平板上生长的疑似沙门菌或志贺菌菌属的菌落进行染色镜检后，进行纯培养和初步生化试验，再将纯培养物使用半自动细菌生化鉴定仪进行生化试验，用血清学试验进行沙门菌或志贺菌菌属菌属和型别的鉴定。每个步骤的培养温度均为37℃。检测过程质量控制：操作过程均无菌操作，并使用没有接种任何物质的培养基做为空白对照，使用大肠杆菌ATCC25922标准菌株做为阴性对照，使用甲型副伤寒沙门氏菌CMCC（B）50093标准菌株做为沙门氏菌检测的阳性对照，使用痢疾志贺氏菌CMCC（B）51252标准菌株为志贺氏菌检测的阳性对照，保证结果的准确性。
1.5 统计学处理
数据的比较采用配对卡方检验。
2 结果
双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案检出沙门菌15份，志贺菌3份，阳性标本共18份，阳性率为0.36%。培养法检出沙门菌12份，志贺菌2份，阳性标本共14份，阳性率为0.28%。
双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案检测阳性而培养法检测阴性的标本有4份，双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案检测阴性而培养法检测阳性的标本有0份。
以培养法做为“金标准”进行分析，双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案的灵敏度为100%，特异性为99.64%（灵敏度=A/(A+B)×100%=14/(14+0)×100%=100%，特异性=D/(C+D)×100%=4982/(18+4982)×100%=99.64%）。双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案和培养法两种检测方法的阳性率经配对χ2检验，两者的阳性率结果无显著性差异（P>0.05）。见表1。
双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案在5 h内可完成整个检测过程，每天300份标本的工作量只需1人便可完成，使用PCR仪器自动化检测，减少了工作环节上工作人员对标本的接触，也减少了玻璃器皿的使用，在生物安全方面保护了工作人员，每份标本的试剂耗材成本约为8元。培养法在需5 d以上才可完成整个检测过程，每天300份标本的工作量需4人共同工作才能完成，工作人员需直接接触标本和使用玻璃器皿，生物安全方面需特别谨慎操作，每份标本的试剂耗材成本约为7.8元。两种方法总体比较，双色实时荧光PCR结合标本混合检测方案同培养法相比，具有省时、省力、操作安全，成本接近等优点，两种检测方法的阳性率无统计学差异。见表2。
3 讨论
双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案，采用了双色实时荧光PCR方法，可降低使用单一试剂的成本，对两种细菌同时进行检测，可节省两种细菌分开进行检测的时间。使用标本混合检测方案进行检测，可节约试剂成本和节省逐份标本检测的时间，两者结合还可减少工作人员的工作量，使用PCR仪器自动化检测，减少了工作环节上工作人员对标本的接触，也减少了玻璃器皿的使用，在生物安全方面保护了工作人员。
在从业人员肠道传染病菌检测中，双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案的灵敏度为100%，特异性为99.64%，结果准确特异，与邱亚群[4]、李光伟[5]、于新芬[6]、邓文星[7]和钟伟军[8]等对实时荧光定量PCR技术的研究结果相符，具有重要的检测诊断意义。
双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案和培养法两种检测方法的阳性率无统计学差异，成本接近，而且双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案比培养法具有省时、省力、操作安全等优点。综上所述，提示具有快速、准确、自动化和操作安全特点的双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案可做为从业人员肠道传染病菌快速筛查的技术方法。
[参考文献]
[1]石晓路，扈庆华，张佳峰,等.多重实时PCR快速同时检测沙门氏菌和志贺氏菌[J].中华流行病学杂志,2006,27(12):1053-1056.
[2]李义强,杨福荣,孔繁玲,等.标本混合检测与逐份样品采用PCR双色荧光检测试剂检测结果比较[J].中国现代医药杂志,2010,12(3):7-8
[3]李义强,何卓雅,梁治贤,等.实时荧光定量PCR检测技术操作规程探讨[J].中国卫生检验杂志,2009,19(4A)：87-89.
[4]邱亚群,扈庆华,汪武新,等.荧光PCR对从业人员肠道致病菌筛查的评价[J].中国热带医学,2009,9(1):12-13.
[5]李光伟,邱杨,肖性龙,等.沙门氏菌荧光实时定量PCR检测试剂的研制及应用[J].微生物学通报,2007,34(3):496-499.
[6]于新芬,潘劲草,孟冬梅,等.多重实时PCR检测沙门菌、志贺菌和致泻大肠埃希菌[J].中华预防医学杂志,2007,41(6):461-465.
[7]邓文星,张映.实时荧光定量PCR技术综述[J].生物技术通报,2007,5:93-95.
[8]钟伟军,赵明秋,邓中平,等.荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌方法的建立及初步应用[J].中国预防兽医学报,2008,30(3):220-224.
（收稿日期：2010-08-09）
