【www.zhangdahai.com--自我评价】
徐 硕，徐文峰，邝咏梅，金鹏飞
北京医院药学部，国家老年医学中心，中国医学科学院老年医学研究院，北京市药物临床风险与个体化应用评价重点实验室(北京医院)，北京 100730
半枝莲为唇形科植物半枝莲ScutellariabarbataD.Don的干燥全草，具有清热解毒、化瘀利尿的功效，可用于治疗疔疮肿毒、咽喉肿痛、跌扑伤痛、水肿、黄疸以及蛇虫咬伤[1]。《中华人民共和国药典》(2020年版)(以下简称《中国药典》)中通过对半枝莲中总黄酮和野黄芩苷含量进行测定，规定含总黄酮以野黄芩苷计不得少于1.50%，含野黄芩苷不得少于0.20%[1]，从而评价半枝莲质量。研究表明，半枝莲中的主要活性成分包括黄酮类、二萜类、生物碱类、甾体、多糖和脂肪族类化合物[2]，具有抗肿瘤、保肝、抗氧化、解热及抗炎等多种药理作用[2-3]。本文对近年来半枝莲质量评价方面的研究结果进行综述，以期为更好地开发和利用该药材提供参考依据。
孟楣等[4]对半枝莲采集品的茎和叶横切面、全草粉末的显微特征进行观察，找出其显微鉴别特征。杨祚荣等[5]主要通过分析性状特征对半枝莲与半边莲进行鉴别。付桂芳等[6]对半枝莲及其混淆品并头黄芩、直萼黄芩、韩信草、荔枝草和半边莲等6种药材进行了性状以及全草粉末、横切面显微特征的比较，为药材的鉴定提供依据。
陈香爱等[7]建立了半枝莲药材的高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)指纹图谱。采用C18柱，以甲醇-乙腈-0.5 mL·L-1磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为280 nm，样品用体积分数为60%的乙醇超声提取，对30批药材样品进行检测。建立了半枝莲HPLC指纹图谱共有模式，标定了14个共有峰，鉴定了其中4个峰，分别为野黄芩苷、木犀草素、黄芩素和汉黄芩素，24批半枝莲药材的相似度均在0.7以上，6批混淆品均在0.4以下。HPLC指纹图谱鉴别半枝莲及其混淆品具有重复性好、特征性强及方法简便等特点，可作为半枝莲药材的鉴别方法。
王慧彬等[8]在已确定的半枝莲HPLC指纹图谱基础上，通过高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱(high performance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，HPLC/Q-TOF-MS)技术，对13个共有峰进行鉴定。采用 Discovery C18柱，以甲醇-0.5 mL·L-1甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为335 nm，采用ESI源，正离子模式检测。通过一级和二级质谱，得出黄酮类成分的裂解方式，结合相关文献，鉴定了其中10个共有峰。
赵伟伟等[9]建立了半枝莲药材的HPLC指纹图谱，样品中加入体积分数为70%的甲醇超声提取，采用C18柱，以乙腈-2 mL·L-1磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为270 nm。结果显示，其精密度、重复性和稳定性良好，以野黄芩苷作为对照峰，标定了13个特征峰为共有峰。采用中药色谱指纹图谱相似度软件进行评价，8份药材的相似度为0.953～0.768，主成分分析获得2个主要成分，累积贡献率达80.347%。应用指纹图谱并结合主成分分析，能为半枝莲药材的质量评价提供参考。
3.1 有效部位的含量
郗玉玲等[10]通过紫外分光光度法(ultraviolet spectrophotometry，UV)测定半枝莲中总黄酮含量，样品用体积分数为80%的乙醇加热回流提取，用碳酸钙吸附除去鞣质和叶绿素，以野黄芩苷为对照品，在335 nm波长处测定吸光度值A。结果显示，野黄芩苷质量浓度在0.002 6～0.013 0 mg·mL-1范围内与吸光度有良好的线性关系，加样回收率为97.59%。任强等[11]采用UV法测定不同产地半枝莲中的总黄酮含量。样品加入体积分数为75%的甲醇超声提取，以黄芩苷为对照品，在277 nm波长处测定吸光度值A，结果显示，黄芩苷质量浓度在2.4～12.0 μg·mL-1范围内线性关系良好，加样回收率为94.3%～96.8%，对不同产地的15批药材样品进行测定，总黄酮含量分别为0.97%～2.70%，含量差异较为明显，其原因可能是半枝莲产地的土壤、气候和光照等多种因素导致总黄酮含量的差异。陈桂等[12]对利用超声辅助半仿生法提取半枝莲总黄酮的实验条件进行考察，采用单因素考察超声功率、提取时间、料液质量比、提取温度和乙醇体积分数等因素对提取率的影响，得出最佳实验条件为：超声功率60 W、提取时间30 min、料液质量比为1∶30、提取温度60 ℃、提取溶剂乙醇体积分数为60%，在该条件下总黄酮提取率为2.14%。张洪坤等[13]采用紫外分光光度法测定不同采收期半枝莲中总黄酮含量，以野黄芩苷为对照品，结果显示，不同采收期总黄酮含量由大到小依次是7、9、5月，不同生长期含量由大到小依次是开花期、开花前和果实期。
夏于芬等[14]通过紫外分光光度法对贵州不同产地半枝莲中的多糖含量进行测定，样品经石油醚脱脂，加入复合酶酶解，之后加入体积分数为95%的乙醇沉淀多糖，以D-无水葡萄糖作为对照品，在490 nm波长处测定吸光度值A，结果显示，D-无水葡萄糖的质量浓度在2.44～16.50 μg·mL-1范围内线性关系良好，加样回收率为98.55%。测定了11 批样品，结果表明，贵州省东部地区产出的半枝莲多糖含量高于西部地区，贵州东南部镇远一带产出的半枝莲药材多糖含量最高，该研究可为黔产半枝莲的种植与开发提供参考。李洁等[15]采用UV法测定了不同产地半枝莲中的多糖含量，结果显示，云南墨江、江苏南通、湖南华宁、福建永定、安徽利辛、广东蕉岭、江西南昌、广西龙胜、湖北洪湖和浙江庆元半枝莲中多糖的含量分别为8.12%、7.61%、6.61%、6.07%、5.84%、4.61%、3.15%、2.69%、2.65%、2.34%，其中以云南墨江半枝莲中多糖含量最高。表明不同产地和栽培方式对多糖含量有较大影响，含量差异可能与植物的生长环境、温度和湿度等多种因素有关。
3.2 药材中单体成分的含量测定
3.2.1HPLC法 邹箴蕾等[16]对不同采收时间半枝莲中的野黄芩苷含量进行测定，采用Lichrospher C18柱，流动相为甲醇-30 mL·L-1乙酸水溶液(29∶71)，检测波长为335 nm，结果显示，6、7、8月采收的半枝莲中野黄芩苷含量分别为0.59%、0.78%、0.16%，7月含量最高，建议在茎叶茂盛的7月采收。
李洁[17]采用HPLC法测定半枝莲不同药用部位野黄芩苷的含量，结果显示，野黄芩苷在0.38～3.80 μg范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率为99.52%，不同药用部位含量差异较大，其中以叶含量最高，为0.842%，以根含量最低，为0.223%，含量顺序由高到低依次为叶、茎、全草、花和根，为临床分部位入药提供一定依据。
刘小莉等[18]通过HPLC-电化学检测(high performance liquid chromatography -electrochemical detection，HPLC-ECD)法，建立了同时测定半枝莲中原儿茶酸、p-香豆酸和木犀草素含量的方法。采用Gemini-C18柱，流动相为甲醇-30 mL·L-1醋酸水溶液，梯度洗脱，电化学检测器的工作电位为0.9 V，样品提取采用索氏提取法，先用石油醚(60～90 ℃)提取，再用甲醇提取。结果显示，原儿茶酸、p-香豆酸和木犀草素的线性范围分别为0.14～11.28、0.29～9.25、0.58～9.31 μg·mL-1，加样回收率分别为97.7%、100.1%、100.9%，测定的3批商品半枝莲中原儿茶酸、p-香豆酸和木犀草素的含量分别在221.4～281.9、92.5～141.1、139.4～155.8 μg·g-1范围内。
康安等[19]建立了同时测定半枝莲中木犀草素、芹菜素、汉黄芩素、半枝莲生物碱A和半枝莲生物碱B的方法。样品先后用石油醚、甲醇索氏提取，采用Phenomenon C18柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，检测波长为355 nm(木犀草素、芹菜素)、254 nm(汉黄芩素、半枝莲生物碱A和半枝莲生物碱B)。结果显示，5种成分在各自质量浓度范围内线性关系良好，加样回收率为97.1%～102.4%，测定6批样品中木犀草素、芹菜素、汉黄芩素、半枝莲生物碱A和半枝莲生物碱B的含量分别在3.45～6.80、12.24～27.13、2.21～3.91、8.46～16.74、4.57～8.65 μg·g-1范围内。
WEI M C等[20]建立了以热回流-超声辅助提取法提取半枝莲药材，通过HPLC技术测定半枝莲中芹菜素、黄芩苷和木犀草素3种黄酮类成分含量的方法。经优化后的提取条件为：超声波频率为40 kHz，功率为185 W，提取温度为50 ℃，料液比为12∶1，乙醇体积分数为60%，提取时间为30 min，提取次数为3次。与传统的热回流提取法相比，该方法能缩短提取时间，降低提取温度和溶剂消耗，且目标成分的提取率更高。测定5批药材中芹菜素、黄芩苷和木犀草素的含量分别为1.146～1.984、0.127～0.206、0.289～0.438 mg·g-1。
殷文杰等[21]测定半枝莲中熊果酸的含量，采用Agilent SB-C18柱，以甲醇-20 mL·L-1乙酸水溶液为流动相，检测波长为210 nm，结果显示，熊果酸在0.024 5～0.491 8 mg·mL-1范围内线性关系良好，加样回收率为98.7%，测定得5批药材中熊果酸含量为0.656～2.846 mg·g-1。
刘勇等[22]建立了半枝莲中原儿茶酸和香草酸的含量测定方法。样品用甲醇加热回流提取，采用Zorbax SB-C18柱，以甲醇-2 mL·L-1磷酸水溶液为流动相，检测波长为260 nm，结果显示，原儿茶酸和香草酸质量浓度分别在2.66～31.92、2.86～34.32 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，检出限分别为0.56、0.57 μg·mL-1，回收率分别为101.4%、99.4%，对4个产地的5批药材进行测定，原儿茶酸和香草酸的含量分别为28.5～68.6、38.9～90.2 μg·g-1，其中产地为江苏的含量均较高。
付小凯等[23]建立了同时测定半枝莲中对香豆酸和肉桂酸含量的方法。采用 Eclipse SB-C18柱，流动相为乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液，梯度洗脱，检测波长为310 nm(对香豆酸)、280 nm(肉桂酸)，结果显示，香豆酸和肉桂酸分别在0.148～1.776、0.062～0.992 μg范围内呈良好的线性关系，加样回收率分别为99.4%、99.3%。对6个产地的8批药材进行测定，结果显示，香豆酸和肉桂酸含量分别为99.3～197.5、37.9～92.4 μg·g-1，产地为湖北的样品中2种成分含量总体优于其他产地样品。
王治阳等[24]建立了同时测定不同产地半枝莲中野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、异野黄芩素、木犀草素、芹菜素、黄芩素和汉黄芩素8个黄酮类成分含量的方法。样品加入体积分数为70%的甲醇超声提取，采用Agilent ZORBAX SB-C18柱，以乙腈-1 mL·L-1甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为350 nm。结果显示，8个成分在各自浓度范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率为98.9%～99.9%，对来自8个产地的药材样品进行测定，野黄芩苷、黄芩苷、野黄芩素、异野黄芩素、木犀草素、芹菜素、黄芩素和汉黄芩素的含量分别为1.73～5.73、0.61～2.73、0.51～2.31、0.69～1.97、0.29～1.13、0.29～1.04、0.74～2.37 mg·g-1。不同产地的含量差异较大，产地为安徽亳州、河南郑州以及甘肃平凉的样品含量相对较高。该研究能为半枝莲药材及其相关制剂的质量控制提供科学依据，并为该药材的栽培提供参考。
田新宇等[25]建立了测定半枝莲中野黄芩苷、芹菜素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、野黄芩素、异高山黄芩素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木犀草素、4′-羟基汉黄芩素和芹菜素7种黄酮类成分含量的HPLC方法。样品用甲醇超声提取，采用Fortis C18柱，野黄芩苷、芹菜素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的流动相为乙腈-10 mL·L-1乙酸水溶液，野黄芩素、异高山黄芩素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木犀草素、4′-羟基汉黄芩素和芹菜素的流动相为甲醇-1 mL·L-1磷酸水溶液，均为梯度洗脱，检测波长为335 nm。结果各成分线性关系良好，加样回收率为96.15%～103.47%。
赵一帆等[26]建立了测定半枝莲中二萜类生物碱scutebarbatine A的方法。采用Agilent-Eclipse XDB-C18柱，流动相为甲醇-水(60∶40)，检测波长为260 nm，样品加入二氯甲烷提取，结果显示，scutebarbatine A线性范围为0.030 34～1.213 6 μg，加样回收率为100.2%。测定了不同产地的10批药材，scutebarbatine A含量为19.209～215.617 μg·g-1，产地为江西省赣州、南昌和四川省的药材中该成分含量较高，而江苏省内不同地区的含量具有明显差异，可能与不同纬度、不同气候条件及地理位置差异有关。
张洪坤等[13]测定半枝莲中野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素和芹菜素的含量，并以水溶性、醇溶性浸出物为评价指标。采用YMC Hydrosphere C18柱，流动相为甲醇-1 mL·L-1磷酸水溶液，梯度洗脱，检测波长为335 nm，结果显示，野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素和芹菜素的加样回收率分别为100.8%、95.3%、95.2%、92.1%，7月开花期采收的半枝莲中野黄芩苷和浸出物含量最高，而木犀草素、芹菜素含量表现出不同的规律，木犀草素含量随着月份的推后而升高，芹菜素含量则相反，头茬半枝莲含量最高，但与7月采收期的差别均不大。因此建议应以7月开花期为半枝莲的最佳采收期。
3.2.2液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)法 焦燕等[27]采用液相色谱-二级质谱联用(liquid chromatography-secondary mass spectrometry，LC-MS/MS)技术，建立了测定半枝莲中野黄芩苷和芹菜素含量的方法。采用Discovery C18柱，以乙腈-1 mL·L-1醋酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为335 nm，采用电喷雾电离源(ESI)、负离子模式检测，野黄芩苷与芹菜素选定的母离子和子离子分别为m/z 461/285，m/z 269/117，质量浓度在2.6～72.7、2.3～63.8 mg·L-1范围内线性关系良好，测定了12个产地的半枝莲药材12批，结果显示，野黄芩苷和芹菜素的含量分别为0.03%～0.39%、0.02%～0.30%，回收率分别为99.1%、97.3%。
YANG Y C等[28]采用加热回流提取与超声辅助提取联用技术对半枝莲进行提取，通过LC-MS法测定药材中的芹菜素、黄芩素、黄芩苷、木犀草素、柚皮素和汉黄芩素6个黄酮类成分，这种提取方法对于黄酮类成分的提取率分别比超声辅助提取法和回流提取法高8.1%～9.2%、18.3%～21.1%，6个成分在各自质量浓度范围内线性关系良好，检测限为0.039～0.078 μg·mL-1，定量限为0.113～0.244 μg·mL-1。
3.2.3气相色谱质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法 曹英夕等[29]对不同产地半枝莲的挥发性成分进行分析比较，分析了江苏、广西、江西、湖南和四川省5个产地半枝莲的挥发性成分，用归一化法计算各成分的相对含量。结果显示，从5个产地的半枝莲中共鉴定出挥发性化合物45个，有13个共有成分，分别为1-辛烯-3-醇、3, 7-二甲基-1, 6-辛二烯-3-醇甲酸酯、苯乙醇、甘菊环、2-甲氧基-3-(2-丙烯)苯酚、1, 2-二甲氧基-4-(2-丙烯)苯、十五烷、2-甲基-1-(1, 1-二甲基乙基)-2-甲基-1, 3-丙二醇丙酸酯、正十六烷、6, 10, 14-三甲基-2-十五烷酮、十六酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯和十六烷酸，这13个共有峰可作为半枝莲挥发性成分中特征性指标成分，但不同产地药材中所含挥发性主成分有较大差异。
王兆玉等[30]对半枝莲全草挥发油成分进行提取，采用GC-MS法分析，并用归一化法计算各成分相对含量。结果分析得到83个峰，确定了其中54种化合物(占65.06%)，其中含量占1%以上的化合物有11种，总相对含量为70.21%，含量相对最高的3种物质依次是棕榈酸(占34.07%)、亚油酸(占13.21%)、叶绿醇(占5.90%)。
3.2.4毛细管胶束电动色谱法 米璇等[31]建立了同时检测半枝莲及其膏剂中黄芩素、柚皮素、汉黄芩素、野黄芩苷、芹菜素、木犀草素和原儿茶酸7种有效成分的方法。样品加入甲醇超声提取。分离运行缓冲液为50 mmol·L-1硼砂溶液-0.20 mol·L-1硼酸溶液(pH 8.4)，含8.5 mmol·L-1十二烷基硫酸钠，分离电压为25 kV，检测波长为260、335 nm。7种成分可在12 min内达到基线分离，各成分在8×10-6～3.2×10-4mol·L-1范围内线性关系良好，检出限在7.0×10-8～2.0×10-6mol·L-1范围内，回收率均大于85%。
3.3 微量元素的含量测定
席荣英等[32]采用原子吸收分光光度法对半枝莲中的铁、铜、锌、锰、镁、硒、锗和钼8种微量元素进行测定，样品加入浓硝酸消解后进行分析，结果显示，半枝莲含有丰富的人体必需微量元素，其中镁的含量最高，铁、铜较高，其次是锌、锰等。
半枝莲的质量评价研究主要包括性状和显微鉴定、指纹图谱研究及含量测定，其中含量测定报道较多，但也存在一些问题。对半枝莲指纹图谱中共有峰的指认还需深入，已有报道指认的几乎均为黄酮类，需加强其他类型化学成分的鉴定。目前黄酮类成分含量测定的研究较多，仅有少数测定生物碱或酚酸类，需加强药材中不同类型化学成分同时定量分析的研究，还需结合LC-MS/MS技术测定其中微量成分，LC-MS/MS法具有灵敏度高、操作简便和分离效果好等优势，广泛用于复杂体系中微痕量成分的准确定量[33]。仅有1篇报道采用原子吸收分光光度法测定半枝莲中8种无机元素，可尝试将电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)法应用于元素测定，ICP-MS法是目前公认的能同时测定多种元素的常用方法，具有分析速度快、灵敏度高和操作简便等优点，解决了原子吸收光谱对元素逐个分析的问题[34]。应建立半枝莲药材中多种无机元素的含量测定方法，并测定不同产地、不同采收期和生长期样品，比较所含微量元素差异，为全面评价药材质量提供科学依据。
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