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李佩桐 时彬冕 许春梅 谢旭东 王骏
口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙周病科 成都 610041
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的异质性多能干细胞群。MSCs不仅是支持组织生长发育的重要干细胞群，也在组织损伤修复和再生中发挥重要作用。特定的表面标记物是MSCs的重要特征，也是其分离、鉴定的主要依据。根据国际细胞治疗学会（The International Society for Cellular Therapy，ISCT）的定义，MSCs的表面标记物特征为CD105、CD73和CD90的表达呈阳性，CD45、CD34、CD14（CD11b）、CD79α（CD19）和人类白细胞抗原-DR （human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）的表达呈阴性[1]。目前关于MSCs的研究大多围绕MSCs体外分离、鉴定、培养和体内细胞移植进行，然而由于体内外环境的巨大差异，体外研究的表面标记物表达与体内效应之间并非完全对应[2-3]。研究MSCs特殊的体内标记物对于阐明其在体内的分布及作用至关重要。近年来，研究者们通过细胞谱系示踪技术发现Gli1是多种组织器官中间充质干细胞可靠的体内标记物，在牙[4]、 牙 周组 织[5]、 骨[6]、肾[7]、 肝[8]、 肺[9]、心 脏[10]和肌肉[11]等组织器官中均有报道。本文对Gli1阳性（Gli1+）MSCs在牙及牙周组织中的分布与作用的研究进展作一综述。
Nüsslein-Volhard等[12]在果蝇的遗传学研究中发现了Hedgehog（Hh）信号通路。Hh信号通路是一条高度保守的信号通路，在胚胎发育中参与细胞分化、细胞间相互作用和组织形成。经典Hh信号通路是由七跨膜转导蛋白Smoothened（Smo）介导的一类细胞内级联反应，在组织生长发育和损伤修复中发挥重要作用[4,13-14]；
非经典Hh信号通路是不依赖于Hh配体或Smo蛋白的一种潜在信号通路，在肿瘤相关研究[15]中发现，非经典Hh信号通路中Gli转录因子的异常激活与恶性肿瘤的形成相关。
Patched1（Ptch1）是细胞膜上含有12个跨膜区段的受体蛋白，是经典Hh-Gli1信号通路的主要受体[16]。在非激活状态下，Ptch1通过抑制Smo的信号传导阻断经典Hh信号通路[17]。当Hh蛋白与Ptch1结合时，Ptch1对Smo蛋白的抑制作用被解除并传递Hh信号到细胞质，激活Ci转录因子家族（Cubitus interruptus，在脊椎动物中多为Gli）并移位到细胞核，影响下游靶基因转录[18-20]。Ci/Gli家族中，Gli1是Hh信号通路中一个重要的转录因子。研究[4,21]表明：Gli1+细胞参与调控牙及牙周组织的发育、再生和稳态维持。
2.1 Gli1+MSCs的鉴定与在切牙中的分布
啮齿动物的切牙在一生中持续生长[22]，其下颌切牙的上皮与间充质区域每个月都能完全更新[23]，是研究干细胞的经典模型。早期研究表明，Gli1[24]与NG2[25]分别是牙齿上皮干细胞与MSCs的标记物。为探究Gli1能否作为牙齿MSCs的标记物，Zhao等[26]构建了Gli1-LacZ小鼠，并检测Gli1在切牙间充质的表达，结果显示：Gli1的表达模式与MSCs具有相似性。对Gli1+细胞与NG2+细胞进行体外培养发现：近95%具有CD146、CD105、Sca1等MSCs经典标记物的细胞来自Gli1+细胞，而NG2+细胞占比小于10%，这说明Gli1更适合作为牙齿MSCs的标记物[26]。
Zhao等[26]研究显示：Gli1+MSCs在切牙中主要分布于颈环，增殖于短暂扩充细胞（transit amplifying cells，TACs） 区域，对Gli1+MSCs与TACs的双重标记也证实了它们具有相同的时空分布规律。同时，谱系示踪表明切牙颈环中央的神经血管束（neurovascular bundle，NVB） 是Gli1+MSCs 的干细胞龛，为其增殖分化提供营养支持与信号调控。在4周的时间里，起始于颈环的Gli1+细胞即可到达切牙顶端，替代全部间充质细胞。这些细胞沿牙本质内表面排列，呈现出向顶端分化程度逐渐增高的趋势[26]。
2.2 Gli1+MSCs在切牙生长发育中的作用
Gli1+MSCs对切牙牙本质的发育具有重要作用。有学者认为上皮的局部增厚是该处牙胚开始发育的标志[27-28]，而增厚上皮周围的牙间充质中能检测到Gli1的表达[4]。Dassule等[29]在上皮发育后敲除Sonic hedgehog（Shh）基因，观察到间充质中Gli1与Ptch1的表达均降低，MSCs形态与排列不规则，并且切牙牙齿体积明显小于正常水平。在牙胚发育过程中，Zhao等[26]明确了由NVB感觉神经分泌的Shh蛋白可以激活其动脉周围的Gli1+细胞，促进间充质的产生，验证了Shh对切牙的生长发育具有促进作用。Chen等[30]还发现了位于MSCs和TACs之间的Runx2+/Gli1+细胞亚群，这些辅助细胞可以帮助维持NVB的功能，从而调节切牙生长速率。
当Gli1+细胞离开NVB进入TACs区域后，激活的骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号将促进其向成牙本质细胞分化[31]。当切牙发育至钟状期，牙周膜通过分泌细胞黏合素（Tenascin-W/TNN），参与调节Gli1+细胞的功能。缺乏细胞黏合素时，切牙间充质中Gli1表达、MSCs增殖以及根尖间充质细胞分化均受到明显抑制[32]。
2.3 Gli1+MSCs在切牙维持稳态中的作用
Gli1+MSCs已被证实在切牙间充质细胞的快速更新中发挥重要作用[33]。小鼠切牙的持续磨耗使得切端的成牙本质细胞与矿化组织不断被消耗[34]，而Gli1+细胞可以通过定向迁移[35]与形成修复性牙本质[26]的方式补充切牙顶端。这一过程依赖的BMP信号在成牙本质细胞中高度活跃，向其提供反馈以维持切牙的稳态平衡。反之，Gli1+细胞中BMP信号缺失将导致切牙更新中断[31]。Shi等[31]还发现：Wnt/FGF信号的激活与Gli1+MSCs在TACs区域的快速增殖高度相关，而BMP信号则可以抑制Wnt/FGF信号，并且促进TACs向成牙本质细胞的分化，表明BMP信号对Gli1+MSCs增殖与分化均发挥重要调控作用。
3.1 Gli1+MSCs在磨牙中的分布
Gli1+细胞在磨牙牙胚发育中广泛分布，而在发育初期主要分布于牙髓顶端，随着时间的推移，Gli1信号在牙髓中心表达增强，在新生牙根的根髓中也检测到大量子代细胞[36-38]。这样的时空变化与牙齿从牙冠向牙根发育的顺序一致。Gli1+细胞在磨牙中拥有与切牙相似的细胞龛，这些细胞主要环绕NVB，并受到感觉神经分泌的Shh信号调控。随着磨牙发育，Gli1+细胞逐渐分化为成牙本质细胞，而Gli1+细胞比例不断降低，最终在分化末期的成牙本质细胞中未检测到Gli1的表达[5]。
3.2 Gli1+MSCs在磨牙生长发育中的作用
Hardcastle等[39]证实：在磨牙牙胚发育初期，Gli1在上皮组织与周围的间充质中均有表达。Li等[37]观察到牙本质小管由更多的分支小管组成，被Gli1标记的成牙本质细胞突就分布于这些小管中。Liu等[38]应用Gli1-CreERT2/+;R26RDTA/+转基因小鼠，在磨牙牙根发育前特异性诱导消融Gli1+MSCs，导致磨牙牙根发育障碍，形成短根。这些结果表明，Gli1+MSCs是磨牙牙根发育的重要干细胞，Gli1+细胞对磨牙牙本质形成、牙根的生长发育起着关键作用。
在磨牙的发育过程中，多种信号参与调节Gli1+MSCs的功能。Shh信号的缺失将导致磨牙体积显著减小与Gli1表达下调，MSCs向成牙本质细胞的分化也受限[29]。Feng等[40]鉴定了磨牙间充质中BMP信号下游的多个转录因子（Pax9、Klf4、Satb2、Lhx8等），在BMP信号的作用下，与维持干细胞未分化状态相关的转录因子（如分布于牙根的Pax9）被抑制，而与分化相关的转录因子（如分布于牙源性区域的Klf4、Satb2、Lhx8）则被激活。这样的空间特异性表达有助于Gli1+MSCs的分化，从而促进磨牙发育。
4.1 Gli1+MSCs在牙周组织中的分布
Gli1-LacZ小鼠被广泛用于研究体内Gli1基因的表达模式。Men等[5]对Gli1-LacZ小鼠第一磨牙切片进行X-gal染色，在小鼠出生的第1、7和14天（P1、P7和P14），整个牙胚中都发现存在Gli1+细胞。在P21，Gli1+细胞主要分布在根尖牙周膜中，少量分布在牙髓、牙槽骨骨髓间隙和非根尖牙周膜内，而在骨细胞、成牙骨质细胞和成牙本质细胞中基本没有分布。王韵等[21]同样发现：3周龄小鼠牙周膜内含有大量的Gli1+细胞（尤其在根尖1/3处）；
随着时间推移，牙周膜内Gli1+细胞的数量不断减少。
Men等[5]进一步通过组织透明化成像技术，从三维立体视角可视化及量化分析Gli1-CreERT2;Ai14小鼠磨牙中Gli1+细胞的空间分布模式，发现60%的Gli1+细胞位于根尖牙周膜间隙，18%位于根中部牙周膜间隙，10%位于根颈部牙周膜间隙，还有10%在牙槽骨骨髓间隙或牙髓中，而在牙骨质和牙槽骨的成骨细胞中没有Gli1+细胞的分布。
以上研究表明，Gli1+细胞在早期牙周组织中主要分布在根尖牙周膜，并随着时间的推移，牙周膜内Gli1+细胞的数量不断减少。
4.2 Gli1+MSCs在牙周组织生长发育中的作用
Men等[5]通过体外实验证实Gli1+细胞具有成纤维、成骨和成软骨分化潜能。王韵等[21]应用细胞谱系示踪技术结合免疫荧光染色发现，自3周龄小鼠诱导标记Gli1+MSCs后21 d，牙周膜内的Gli1+细胞及其子代细胞表现出多向分化的潜能。在牙周膜内，大量Gli1+细胞群分化为成纤维细胞，并表达骨膜蛋白。随着牙骨质的发育，部分Gli1+谱系细胞分化为牙骨质细胞，同时表达牙骨质基质蛋白1。Xie等[41]研究了Gli1+细胞在牙骨质发育中的调控机制，发现在Gli1+细胞中持续激活Wnt/βcatenin信号通路可导致牙骨质的过度增生；
反之，敲除Gli1+细胞的β-catenin基因，下调Wnt信号活性将抑制Gli1+细胞向成牙骨质细胞的分化。在牙槽骨中，Gli1+细胞及其子代细胞逐渐分化为成熟的骨细胞。综上，Gli1+细胞具有分化成纤维细胞、牙骨质细胞和骨细胞的潜能。Gli1+细胞是牙周组织再生的潜在种子细胞[5]。
4.3 Gli1+MSCs参与牙周组织的损伤修复和稳态维持
Men等[5]通过构建Gli1-CreERT2;Ai14小鼠磨牙根分叉损伤模型，应用细胞谱系示踪技术发现：在损伤后第7天，Gli1+细胞来源的细胞分化为根分叉区部分的牙周膜成纤维细胞；
第30天，损伤根分叉区几乎全部牙周膜细胞和部分骨细胞都由Gli1+细胞及其子代细胞分化而来，提示Gli1+细胞对于牙周组织损伤后修复有重要作用。
Gli1+MSCs还参与了正畸力诱导下的骨改建。Liu等[42]建立小鼠正畸牙移动（orthodontic tooth movement，OTM）模型，与对照组相比，OTM组牙周膜中的Gli1+细胞数量及比例在张力侧增加，在压力侧减少，提示Gli1+细胞可能参与牙移动过程中牙周膜的稳态维持。此外，对小鼠使用小剂量Gli1抑制剂GANT61或敲除Gli1基因，发现小鼠牙周膜压力侧变窄，张力侧变宽，表明抑制Gli1活性可导致牙齿移动受限和抑制牙槽骨重建。Yap蛋白（Yes-associated protein）是一种将机械信息转化为细胞生物信息的机械传感器。研究[43-44]发现，Gli1+细胞的细胞核内表达活化的Yap蛋白。在机械应力作用下，Yap去磷酸化后被激活，进而转移到细胞核内激活下游基因转录，提示Yap的活化是Gli1+细胞响应机械力刺激的关键。综上，Gli1+细胞在调控牙周组织改建中发挥关键作用。
Gli1是MSCs重要的体内标记物，Gli1+MSCs参与全身多个器官的生长发育与稳态维持。在口腔中，Gli1+MSCs主要分布于颈环、牙周膜等处的NVB周围，在一定条件下可被诱导分化为成牙本质细胞、成纤维细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞（图1），从而在牙、牙周组织的发育、损伤修复和改建中发挥重要作用。
图1 Gli1+MSCs在牙及牙周组织的分布与分化Fig 1 The distribution and differentiation of Gli1+MSCs in teeth and periodontal tissues
近年来，Gli1+MSCs的多向分化潜能在细胞疗法与再生医学方面获得越来越多的关注，使得Gli1+MSCs具有良好的临床应用前景。同时，多学科领域交叉也为Gli1+MSCs的研究提供了新的思路与方向：如Gli1+MSCs与外泌体[45]、生物材料[46-47]等领域的结合均取得了不错的成果。然而，就目前的研究而言，仍缺乏对Gli1+MSCs在体内特性与作用的全面认知，相关体内研究仍有待开展，这在一定程度上限制了其临床应用。
利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。
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