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【摘要】 目的对422例患者淋球菌，沙眼衣原体和解脲支原体的检测结果进行分析，给临床诊治提供参考。 方法 应用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术对422例患者，取其宫颈、尿道分泌物或前列腺液同时进行NG、CT、UU的检测。结果 422例患者总检出阳性率65.64%，单一感染阳性率54.27%,重叠感染阳性率11.37%。男性316例阳性率67．41%,女106例阳性率60．38%。男女阳性检出率差异无显著的统计学意义(χ2=1．27,P＞0．05)。检测结果显示：UU检出率最高,在UU阳性患者中女性高于男性,差异有显著的统计学意义(χ2=4．20,P[1])。目前STD在我国的发病率有逐渐增多的趋势,卫生部列出淋病、非淋菌性尿道炎等为其中重点防治的对象。为了进一步深入了解淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)在一般人群中的感染率，评估NG、CT、UU在人群中传播的危险性，本文应用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术对422例来自皮肤科、妇产科、泌尿外科的患者，取其宫颈、尿道分泌物或前列腺液同时进行NG、CT、UU的检测，现就其结果分析如下。
1 材料与方法
1．1 标本来源 标本均来自汕头大学医学院第一附属医院皮肤科、妇产科、泌尿外科的422例患者，男性316例，女性106例，年龄23~69岁。用无菌棉拭子插入女性宫颈1~1．5 cm或男性尿道2~3 cm，转动5~10 s并停留数秒后,将棉拭子密闭送检，或经前列腺按摸后取得前列腺液置无菌管密闭送检。
1．2 仪器与试剂 LightCycler TM型核酸扩增仪(德国罗氏公司)；TGL-16G型低温离心机(上海安亭科学仪器厂)；HB-100型恒温金属浴(杭州博日科技有限公司)；HF-safe-760 s型生物安全柜(ClassⅡ,上海力申科学仪器有限公司)。荧光PCR试剂盒由深圳匹基生物工程公司提供(其为国内首家获得核酸扩增荧光体外诊断试剂盒新药证书的生产厂家)。
1．3 检测方法 FQ-PCR法是在常规PCR基础上，添加了一条标记荧光发光分子和一个荧光淬灭分子的双标记探针，前者标记在5′端，后者标记在3′端。完整的探针在激光激发下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，从而无荧光。PCR扩增中，当扩增链在延伸过程中遇到已与模板结合的特异性荧光探针时，具有5′~3′核酸外切酶活性的Taq酶在继续延伸链过程中逐一从5′端切断荧光探针分子，从而使荧光淬灭分子与模板链分开，因而在激光激发下分开的荧光探针在特定波长下发出荧光[2]。其试验方法是严格按试剂盒说明书操作：将棉拭子用1．5 ml生理盐水充分洗涤后吸取混悬液或直接吸取前列腺液100ul，加入100ul核酸提取液A，充分混匀后13 000 r/min，离心10 min，弃上清液，再加入核酸提取液B50ul充分震荡混匀后于100℃裂解10 min，13 000 r/min离心5 min后，取上清液DNA作为反应的模板进行FQ-PCR。反应条件为：93℃5 min预变性，然后按93℃45 s，55℃45 s，进行40个反应循环。反应结束后，由电脑自动分析计算出定量结果。定量阳性质控方法,每批标本均按试剂盒内提供的定量阳性质控标准品，做定量阳性质控。每次检测均做阳性和阴性对照。
1．4 统计学处理 采用Excel 2003统计软件对检测结果进行统计学χ2检验。
2 结果
FQ-PCR检测结果422例患者NG、CT、UU感染情况见表1。
422例患者中既有3种病原体的单一感染，也有重叠感染。总检出阳性277例(65．64%),阴性145例(34．36%),单一感染阳性229例(54．27%),重叠感染阳性48例(11．37%)。单一感染患者中,NG检出阳性72例(17．06%),CT检出阳性58例(13．74%),UU检出阳性99例(23．46%)。重叠感染患者中,NG+CT感染7例(1．66%),NG+UU感染9例(2．13%),CT+UU感染28例(6．63%),NG+CT+UU感染4例(0．95%)。男性316例中,阳性213例(67．41%)。女性106例中,阳性64例(60．38%)。男女阳性检出率差异无显著的统计学意义(χ2=1．27,P＞0．05)。检测结果显示：UU检出率最高,在UU阳性患者中女性高于男性,差异有显著的统计学意义(χ2=4．20,P[3，4],女性解脲支原体感染率较高,可能与女性患者症状不明显,病程较长有关。UU在正常泌尿生殖道中有较高的检出率,其致病性尚有争议,因此难以确定尿道(宫颈)炎就是UU引起。对UU感染应结合临床症状及体征具体分析。男女患病阳性率差异无显著的统计学意义;② 422例患者中,单一感染为229例,占54．27%,混合感染为48例,占11．37%,高于国内文献报道的44•3%和6%[5],可能与取样时间和地区差异等有关;③422例中,混合感染占一定比例,可能是一些GU患者在治疗后出现病情反复、迁延、久治不愈的一大原因。临床医生在诊治GU的过程中,应对是否合并CT和(或)UU感染提高警惕,尤其是对GU患者治疗后仍有临床症状者,必须检查CT和支原体,力求早期发现,及时治疗,以提高治愈率。(4)422例中,阴性占145例(34．36%),患者均有尿道(阴道)刺激症状,未进行其它微生物检查,但近来有报道,有尿道(阴道)刺激症状者除NG、UU、CT外,其它微生物感染可达41．7%[5]。建议临床医生在处理尿道(宫颈)炎时,尤其是症状难以消除的病例,除考虑到NG、UU、CT感染外,还应进一步检查排除其它微生物,如真菌、滴虫、疱疹病毒或其它细菌感染,并进行及时而系统的治疗。此外,还应考虑精神因素影响,给予心理治疗。
FQ-PCR技术是把目的基因扩增、特异分子杂交和荧光化学融为一体,PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭的条件下进行,并通过微机控制,实现了PCR扩增产物进行实时动态检测和结果自动分析, 准确的定量拷贝数，它无需PCR后处理和冗长的电泳,解决了常规PCR实验扩增产物污染而导致的假阳性的问题,准确灵敏地反映病原体的感染和治疗恢复情况[6]。同时该技术可对1份标本同时检测数种病原体，满足了简单、快速、准确、特异性强，灵敏度高的实验要求；解决了这类病原体培养条件高，周期性长、阳性率低的问题，避免了患者同时取多份标本的麻烦和标本间差异, 另据文献报导[7],FQ-PCR其敏感性和特异性均高于常规PCR。因此,FQ-PCR操作步骤简单,反应时间短,整个过程可在两小时内完成,结果判定简单客观,灵敏特异且能应用在自动化分析系统中,故而适宜门诊就诊患者初查。
参考文献
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［2］ 赖宏芳,付晓野,董玉琳,等．荧光探针定量PCR检测HBV-DNA．上海医学检验杂志,2000,15(1):18-19．
［3］ 陈家坚．应用聚合酶链反应对淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的检测分析．重庆医学,1999,28(增刊):327
［4］ Hilis SD,NakaShima A, marchbanks PA, et al．Risk factors forrecurrent Chlaamgdia trachomatis infections in women. Am j ob-stet Gynecol,1994,170:801.
［5］ 郑秀峰,郑荣涛,周盛基.性病门诊尿道(宫颈)炎患者病原体检测分析.中国麻风皮肤病杂志,2002,18(2):439.
［6］ Fahle GA, Parker JM, Fischer SH, et al. Rapid and sensitive detection of cytomegalovirus using PCR and the DELFIA time-resolved fluorescence hy bridization assay. Abstr Gen Meet Am Soc Microbiol,1997,97:153.
［7］ Palladino S, Pearman JW, Kay ID, et al. Diagnosis of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Genitouri-nary infections in males by the Amplicor PCR assay of urine.Diagn Microbiol Infect Dis,1999,33(3):141-146.
