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金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都能分离到。健康人的咽喉、鼻腔、皮肤、头发等也常带有产肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株，因此，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌肠毒素引发的食物中毒问题是个世界性卫生问题，在美国由其引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%［1］。我国每年发生的此类中毒事件全国各地都有报道。金黄色葡萄球菌肠毒素是一类结构、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，除了SEA、SEB、SEC、SED、SEE 5种（其中血清型SEC又分为SEC�1、SEC�2、SEC�33种亚型）早已被鉴定的传统血清型外，近年来还发现了SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO和SEU等新型的肠毒素［2-7］。本实验对一起食物中毒事件中分离到的13株金黄色葡萄球菌分别用全自动酶联荧光免疫分析法（VIDAS法）、反向胶乳凝集试验法（RPLA）及聚合酶链式反应法（PCR）进行肠毒素检测，并对这3种方法的检测结果进行分析，最后用DNA指纹图谱法对其进行同源性比对，从而了解金黄色葡萄球菌肠毒素的分布情况。��
1材料与方法�
1.1材料�
1.1.1菌株来源实验所用的13株菌株均来自杨浦区疾病预防控制中心，是从一起食物中毒采集标本中分离所得，并已鉴定为金黄色葡萄球菌。其中1号和2号菌株从2位病人的肛拭中分离得到，其余9株从与这起食物中毒有关的环节中分离得到，包括炊事员的手、外环境等。�
1.1.2仪器与试剂mini VIDAS 全自动酶联荧光免疫分析仪、RiboPrinter指纹图谱仪为美国杜邦公司产品；PCR预混反应液购自上海皓嘉科技发展有限公司,寡核苷酸引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；金黄色葡萄球菌肠毒素反相被动胶乳凝集试验（RPLA）试剂盒购自OXOID公司。�
1.1.3引物选择根据 Becker等［8］报道合成SEA、SEB、SEC、SED、SEE 基因的PCR引物；根据Jarraud 等［9］报道合成SEH、SEI、SEG基因的PCR引物；根据Steven等［10］报道合成SEJ基因的PCR 引物,见表1。 ��
1.2方法�
1.2.1测定肠毒素将分纯的金黄色葡萄球菌接种于BHI肉汤，37℃震荡培养过夜。次日以3000 r/min离心15 min，取上清液2mL再次离心后，将1mL上清液加到1 mL提取缓冲液中混匀，然后取0.5 mL上述混匀液加入SET 2试剂条孔内，用VIDAS 全自动定量酶联荧光免疫测试系统检测肠毒素。�
1.2.2RPLA法肠毒素分型用Oxoid公司的RPLA试剂盒检测A、B、C、D 4种类型肠毒素，根据试剂盒说明书方法检测。�
1.2.3PCR法肠毒素分型①模板DNA的制备将平板上的纯菌落加入到100μL裂解液中，100℃裂解10min，然后以12 500 r/min离心10min，取上清液即为PCR扩增模板。 ②PCR扩增扩增反应总体积为25 μL，其中预混反应液12 μL，模板DNA 2 μL，上游引物(10μmoL/L)1 μL,下游引物（10μmoL/L）1 μL，灭菌双蒸水9 μL。DNA扩增反应条件如下：预变性94℃ 5min，然后进行35次循环的94℃变性 1 min， 55℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延长延伸时间至10 min。上述引物包括SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEJ 9对引物。③电泳PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1.5%，所用的DNA标准分子量（Marcker）购自美华生物工程公司。 ④凝胶成像用凝胶成像仪（中国天能公司）观察PCR扩增条带，并拍照留存。�
1.2.4基因指纹图谱的测定提取13株金黄色葡萄球菌DNA后，选择EcoR I内切酶试剂盒，用Ribo Printer��全自动微生物鉴定系统进行基因指纹图谱的测定，操作步骤按操作手册进行��
2结果�
2.1VIDAS测定肠毒素�
经过上机快速筛选，13株菌株中8株金黄色葡萄球菌肠毒素检测阳性。RPLA试剂盒进行分型试验，结果有2株鉴定为A型，1株为B型，1株为C型，2株为D型。PCR基因分型结果为4号菌株同时带有肠毒素A、E型基因，5号菌株同时带有肠毒素D、I、G、J型基因，8号菌株同时带有C、D、I、G、J基因，见表2。��
2.2电泳�
金黄色葡萄球菌肠毒素基因SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEJ扩增片段大小和文献报道一致，电泳图见图1。
2.3检测�
Ribo Printer系统对13株金黄色葡萄球菌的分析结果为：未能检测到金黄色葡萄球菌肠毒素的3号与9号菌株的相似度最高,为94.3%；其次是分离自病人的1号与2号菌株，其相似度为94.1%；PCR法检测到D、I、J、G肠毒素基因的5号与13号菌株的相似度为93.5%；而分离自病人的1号和2号菌株与环节中的11株金黄色葡萄球菌的相似度仅为47.2%。见图2。�
图2 13株金黄色葡萄球菌16S rDNA指纹图谱及相似度�
注：上图中显示13株金黄色葡萄球菌：第1列聚类分析采用Bio Numerics软件的UPGMA分析，显示出各不同株的相关性；第2列为其EcoR I酶切图谱；第3列为菌株编号��
3讨论�
VIDAS检测系统只能测定SEA、SEB、SEC、SED、SEE 5个型别的金黄色葡萄球菌肠毒素，除此之外的金黄色葡萄球菌肠毒素型别均无法检测，更无法分型，只有存在一种或一种以上上述5种型别的肠毒素才显示为阳性。RPLA也只能检测出A、B、C、D4型肠毒素，超出这4种型别的肠毒素亦无法被检测出。PCR法设计了SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEJ 9对金黄色葡萄球菌肠毒素引物，故能检测出上述相应型别的肠毒素。从表一的结果分析，1号和11号金黄色葡萄球菌肠毒素其VIDAS的检测结果为阳性，而RPLA试验和PCR法均未检出肠毒素，这可能是因为VIDAS检测系统检测原理是酶联免疫分析法，其产生的非特异性结合造成假阳性结果。仅对SEA-SED这4种肠毒素分型结果分析，RPLA和PCR法对这13株金黄色葡萄球菌肠毒素的检测结果完全一致，前者检测的是肠毒素的表型，后者检测的是基因型，有文献［11］报道金黄色葡萄球菌的表达在不同条件下差异很大，毒素基因不表达或表达低时检测不出，而本次实验并未出现类似情况，是否存在像文献报道中的情况还有待于进一步探讨。本次实验结果显示， RPLA法简单，成本低，不需要特殊的设备，但它的不足之处在于只能检测A、B、C、D 4型肠毒素，而且要孵育18~24 h，比较费时，而PCR法弥补了RPLA的不足，显现出灵敏、快速、特异的优势，能在3 h之内检测出肠毒素，并且随着对于金黄色葡萄球菌肠毒素分子生物学的研究不断深入还能检测出A、B、C、D、E型等基因之外的其他新发现的肠毒素基因。另外，VIDAS法虽然不能对金黄色葡萄球菌肠毒素进行分型，但具有方便、灵敏、自动化程度高的特点，对疾控系统快速出结果有重要作用。�
从PCR的结果分析，13株金黄色葡萄球菌中共检出6株金黄色葡萄球菌带有肠毒素基因，并且同时带有2型及以上的肠毒素基因。其中产B型肠毒素比例最低为16.7%（1/6），A、C、E型肠毒素各占了33.3%（2/6），D型和J型肠毒素占了50%（3/6），G型和I型肠毒素的比例最高，占了66.7%（4/6）。20世纪80年代初的研究表明，由携带SEA-SEE基因的金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占金黄色葡萄球菌食物中毒的95%，5%的中毒事件由携带其他肠毒素基因的金黄色葡萄球菌引起［12］。这与此次实验检测到的金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布不相符，可能是与各型肠毒素的毒力强弱有关，也可能与检测方法的局限性有关，抑或可能国外的金黄色葡萄球菌肠毒素的分布情况与国内有所不同。Jarraud等［13］研究表明，如果检测范围扩展到新发现的肠毒素基因，检出率会提高22.2%。Akineden等［14］研究表明，毒素基因的出现和表达也是相互关联的，如SED和SEJ基因总是同时出现，这与本文的检测结果相符。�
rDNA指纹图谱最早于1986年由Grimont等［15］首次报道。该法又称rRNA基因限制性图谱(rRNAgene restriction patterns)或核糖分型(ribotyping),是根据rRNA基因在长期的进化过程中具有高度的保守性的特点，使用对该基因序列特异的探针可与含有这些序列的DNA片段杂交，从而提供了一个只用一种探针分析多种细菌的通用方法，其产生的杂交条带较少，结果的判别较容易。本实验利用微生物鉴定系统，绘制食物中毒事件中分离的13株金黄色葡萄球菌16S rDNA指纹图谱，结合Bio Numerics软件，对其进行同源性分析。其中，分离自病人的1号和2号菌株相似度为94.1%，其亲缘关系很近，可以认为是同一株菌株，而其与环节中的11株金黄色葡萄球菌的相似度仅为47.2%，故可认为环节中的金黄色葡萄球菌可能与这起食物中毒无关。�
为进一步了解新发现的各型金黄色葡萄球菌肠毒素在食物中毒方面所引起的危害，不仅要对不同来源的菌株的各型肠毒素分布进行系统和深入的研究，而且要研究肠毒素基因间的关系、表达情况、毒素性质。由此可见，金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的不断改进和相互验证可以为食源性疾病的预防和控制提供更为可靠的信息和依据。��
4参考文献�
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(收稿日期：2007-12-11)
