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【摘要】 心肌梗死等缺血性心脏病严重威胁人类生存和生活质量,组织工程技术为根治心肌梗死等心脏病提供了一种新的方法,近年来,心肌组织工程有了较大的进展,但在种子细胞等方面的难题还远没有解决。本文对关于间充质干细胞分化为心肌细胞的研究作了一下综述,为细胞替代治疗的研究提供一定的参考。
【关键词】间充质干细胞;心肌细胞;细胞替代治疗
Research advances of mesenchymal stem cells induced into cardiomyocyets
JIANG Jing,LI De-hua.Department of Anatomy,Liao Ning Medical College,Jin Zhou Liao Ning 121001,China
【Abstract】 Ischemic heart disease such as myocardial infarction endanger human health and life,cardiac tissue engineering is one of the new radical therapy for myocardial infarction.In recent years,researchers have made great progress in cardiac tissue engineering,but the problems of seed cells and scaffold materials are far from resolved.This paper reviews research advances of mesenchymal stem cells induced into cardiomyocyets so that it may contribute to Cell therapy.
【Key words】
Mesenchymal Stem Cells;Cardiomyocyets;Cell therapy
在成人肌肉组织中,心肌细胞(Cardiomyocytes,CMs)属于终末分化期永久性细胞,不具有再生能力[1],其对有丝分裂信号作出的反应是细胞肥大[2]而不是再生,致使损伤后心肌再生和修复严重受限,由于心肌损伤后无法通过自身的增殖、分化进行修复,坏死的心肌则由纤维疤痕组织取代[3,4]。研究发现心肌中也含有干细胞[5-7],在心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后这些细胞会发生分裂增生,但数量极少,增殖能力太小,不能完整地修复心肌组织,更不能满足心肌组织再生的需求,致使具有收缩功能的CMs减少,最终发展成充血性心力衰竭、死亡,严重影响患者的生活质量。临床上缺乏对病变冠状动脉的再造和梗死心肌的再生、重建的根本治疗方法,而细胞替代治疗通过移植功能细胞,替代、修复或加强受损的组织或器官的细胞的生物学功能已成为治疗多种组织坏死性疾病的新策略。
1 心肌细胞和间充质干细胞的特点
心肌细胞在出生后就进入了有丝分裂的后期,基本丧失了增生和再生的能力,不再进入细胞周期,而目前尚无证据支持心肌中含有干细胞[1]。成人骨髓中含有造血细胞和非造血细胞,非造血细胞与细胞外基质一起形成了支持造血的骨髓微环境(Bone marrow microenvironment,BMME)[8]。骨髓微环境中的细胞成分包括网状内皮细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、成纤维样细胞[9],这些细胞通过分泌各种细胞因子、生长因子、以及自身细胞表面受体的表达,对造血细胞的附着、分化、自我更新起到了重要作用[10]。目前,普遍认为,在骨髓中至少存在两种干细胞群即造血干细胞(Haematopoietic stem cells,HSCs)和MSCs,前者是所有造血细胞的祖细胞[11,12],后者则是中胚层发育的早期细胞,这类细胞可以通过体外贴壁培养加以分离,不仅能分化为造血实质和基质细胞等,还分化为多种造血以外的组织,特别是中胚层和神经外胚层来源组织的细胞,如脂肪细胞、成骨细胞、CMs、神经细胞等[13-16],MSCs向多种细胞分化及其诱导条件见表1。由于骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)作为骨髓中存在的另一种非造血干细胞的干细胞群具有易获得、易分离、易操作的优点。能够通过骨髓穿刺反复收集、体外大量扩增,取材方便,扩增后自体回输,不必应用免疫抑制剂,成为近年来最具吸引力的心肌种子细胞,具有广泛的临床应用前景。采用生物学技术将骨髓间充质干细胞进行自体心肌内移植,修复损伤心肌组织是近年来心血管病研究领域的一大热点。
表1
MSCs向多种细胞分化的诱导条件
细胞类型诱导物质或细胞因子
成骨细胞地塞米松,β-磷酸甘油,1,25-(OH)�2-D�3,抗坏血酸,BMPs(骨形态蛋白)
骨髓基质血清,PDGF,Hydrocrtisone(皮质醇)
肌腱BMPs,GDFs
肌肉组织5-Aza(5-氮胞苷),PDGF(血小板衍生生长因子),bFGF(成纤维细胞生长因子)
软骨细胞高密度压片培养,无血清培养基,地塞米松,抗坏血酸,TGF-β,BMPs
脂肪细胞地塞米松,IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤),Indomethacin(消炎痛)
2 国外研究趋势
1999年Makino等[17]首次报道MSCs体外成功地向CMs诱导分化,这是一个具有里程碑意义的研究。他们用3μM的
作者单位:121001锦州,辽宁医学院解剖学教研室
5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)对从小鼠骨髓中分离出的MSCs进行体外诱导,发现经5-Aza处理1周后,大约30%的MSCs细胞形态发生改变,细胞体积变大,呈球状或向同一方向延展成棒状,2周后与周围细胞相连,3周后细胞间通过闰盘相连并形成肌管,出现CMs表型,部分细胞克隆可出现自发性收缩;透射电镜观察显示心肌终端样结构,形成的肌管结构中包括典型的肌小节、丰富的糖原颗粒;RT-PCR及Southern blot显示诱导的细胞表达心钠素(ANP)、脑钠素(BNP)、α-MHC、β-MHC、MLC-2v、α-骨骼肌肌动蛋白及α-心肌肌动蛋白;免疫细胞化学染色Myosin、Actin及Desmin阳性;并且诱导的细胞有着几种不同的动作电位,最为典型的是窦房结样和心室肌样动作电位;整个的研究表明小鼠MSCs分化为完全成熟且具有兴奋性、能自发跳动的CMs,并且构建出诱导后的心肌细胞系(Cadiomyocyte cell lines)。这一研究所建立的心肌细胞系为BMSCs移植在缺血性心脏病的治疗提供了应用基础。2000年,Wang等的研究表明,如果BMSCs在体外不经过肌细胞分化诱导,移植到正常心肌组织中也能够产生“环境依赖性分化”,表达心脏的表型。然而,Tomita等在大鼠的冷冻心肌梗死模型上发现,只有预先体外化学诱导的BMSC细胞才能改善2个月后的心脏功能,因此,BMSCs是否必须经过体外的预诱导才能在体内转化为心肌细胞尚无定论[18]。2001年,Orlic等选用eGFP高表达的雄性转基因小鼠,从骨髓中筛选、培养扩增的造血干细胞谱系特异性抗原阴性(Lin-)而干细胞因子阳性(c-kit+)的原始干细胞,冠脉夹闭5 h后注射之急性梗死边缘的正常心肌组织内,9 d后在新修复的心肌块中,来源于血液干细胞的新的心肌细胞达到近70%。新修复的心肌组织中包括了心肌细胞和新生血管。在12只存活小鼠中发现,移植细胞(表达GFP,成绿色荧光)分化为形态较小的肌细胞,与胚胎和新生肌细胞相似,不仅Y染色体阳性,还可以表达一些肌特异性蛋白包括心脏肌凝蛋白,以及转录因子GATA4/MEF2和Csx/Nkx2.5。这些细胞同时也表达闰盘蛋白connexin43。BrdU掺入分裂细胞DNA及核内细胞周期相关蛋白K167的表达提示肌细胞存在增殖分裂。在新生心肌组织中也发现有新生血管的形成。在新生的毛细血管和小动脉中存在eGFP阳性的内皮细胞和平滑肌细胞,分别表达Ⅷ因子和α平滑肌肌动蛋白。而骨髓Lin-c-kit-细胞移植到损伤心肌中没有发生心肌再生。血流动力学参数提示Lin-c-kit+细胞移植后可改善左心功能。这些体内试验的研究结果表明,高度富集的成体骨髓Lin-c-kit+细胞移植能在梗死区分化、增殖,形成大量的心肌细胞群,小动静脉和毛细血管,并与受体心肌细胞、血管连接,与受体心脏融为一体,显著改善心脏功能[19]。2002年,Tomita和同事们继续观察了自体骨髓基质细胞移植对大动物的心肌再生作用。采用缩窄环建立猪的左冠状动脉前降支(left anterior descending artery,LAD)远端心肌梗死模型,抽取髂骨骨髓,分离基质细胞,体外培养,5-氮胞苷诱导分化,在冠脉闭塞后4周行SPECT检查,心肌梗死区注射1×10�8个骨髓基质细胞(BrdU标记),冠脉闭塞后8重复SPECT检查,并进行心肌形态学和组织学分析。发现在梗死区移植细胞呈岛状分布,具有横纹和Z带,表达心肌肌钙蛋白I(cTn I),在移植区由有更大的血管密度,SPECT发现治疗组的射血分数、局部灌注及室壁运动明显改善,压力-容积分析显示收缩弹性末期弹性和左室舒张末期压力均有改善,提示自体骨髓基质细胞移植可形成岛状心肌细胞,促进血管新生,防止左室重塑,提高局部及全心的收缩功能[20]。2002年,Shake等采用犬LAD结扎60 min的心肌梗死模型,心肌梗死后2周将6×10�7个BMSCs注射到心肌梗死区,移植后4周心脏收缩功能改善,提示MSC具有心肌再生的作用。可望成为临床上治疗心肌梗死的有效方法[21]。2005年Yoon等把hBMSCs和新生鼠的心肌细胞共同培养。诱导hBMSCs向心肌细胞分化。表达心肌特异性结构蛋白基因如α肌球蛋白重链基因(α-MHC),以及心肌细胞特异性转录因子Nkx2.5,CATA4和心钠素(ANP)。这个发现证实了hMSCs有向心肌分化的潜能。[22]
3 国内研究趋势
韩永生,等人(2004)将大鼠基质细胞注入同源的大鼠的心脏中。发该细胞表达肌球蛋白重链和连接蛋白43,后者的表达提示了细胞间隙连接的形成。为了明确hBMSCs是否能够植入梗死组织区域。笔者用注射器直接将hBMSCs注入无胸腺大鼠的实验性心梗模型中。在此实验系统中笔者发现hBMSCs能移植入梗死组织区域并存活至少两个月。同时还表达横纹肌蛋白。为满足人类的治疗需求,还进行了另外一些研究即在猪的心梗模型的基础上发展hBMSCs移植的方法和技术。尽管许多工作有待进一步进行,但现有的结果显示植入的hBMSCs能分化出心肌细胞表型,并在心脏组织受损或缺血时能促进细胞性的心脏形成术[23]。贾绍斌等用大鼠BMSCs在诱导剂5-aza的作用下,可以向心肌样细胞方向转化。形态学上BMSCs在5-aza干预后,细胞由原来扁平多角形变成长梭形,部分细胞体积明显增粗,可见到有些细胞间有融样发生,可以有类似肌管样细胞出现。通过RT-PCR发现BMSC经过诱导后与诱导前完全不同,前着表达心肌特异的ANP和BNP基因,此现象揭示诱导后BMSC可向心肌细胞分化[24]。吕铁伟等多人诱导BMSCs分化成心肌细胞,可观察到BMSCs向心肌细胞样形态的改变明显[25,26,27],免疫组化显示cTnI表达阳性率高。说明5-aza能够诱导BMSCs向心肌细胞转化。荧光免疫组化方法鉴定心肌特征性蛋白肌球蛋白重链(MHC)和连接蛋白Connexin43的表达,应用半定量RT-PCR技术分析TGF-β、Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、TEF-1和RARα等相关调控基因在分化过程中的动态时序表达。考虑TGF-β、Nkx-2.5、GATA-4和MEF-2C可能是调控BMSCs定向分化为心肌样细胞的重要调控基因。为进一步细胞移植治疗心肌梗死,改善心功能提供了理论基础,为临床应用提供理论依据和技术支持[28,29]。
汪蕾等(2004)观察心肌细胞(cardiomyocytes,CM)与BMSCs直接接触和非直接接触对诱导BMSCs成心肌样分化的影响。体外以新生大鼠CM与BMSCs直接接触和非直接接触的培养方式模拟心肌微环境,分析BMSCs形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果:直接接触共培养的BMSCs与CM同步搏动,且心肌特异性肌钙蛋白T染色阳性,阳性率为1.3%;而心肌细胞条件培养液无法单独诱导BMSCs的横向分化得出结论:与CM细胞间的直接接触是诱导BMSCs分化为心肌细胞的必须条件,条件培养液则非关键因素[30,31]。郭军等(2004)探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和干细胞因子(SCF)预处理对BMSCs向心肌细胞分化具有促分化作用[32]。
杨志健等体外诱导出能自发跳动的心肌细胞,使采用BMSC修复心肌损伤成为心血管疾病的研究热点。研究利用BMSC可诱导分化为心肌细胞的特点,以幼猪为研究对象,采用经冠脉转运的方法,将培养的自体BMSC移植至心肌梗死区,观察BMSC在心肌微环境下的转归及治疗作用[33-35]。
我国唯一2004年刘维新等人从转录启动到翻译后水平的证据均不支持体外5-aza处理可诱导BMSCs表达心肌特异性蛋白[36]。
4 问题与展望
大量的细胞体外培养诱导和动物体内实验,为细胞移植治疗心血管疾病提供了可能性和科学依据,充分说明MSCs作为心肌干细胞的来源,具有重要的临床意义和良好的应用远景。目前,干细胞在心血管疾病的研究中还处于临床前实验阶段,对于干细胞在心血管疾病中作用的认识也仅是初步的,还存在很多问题亟待解决,如移植的最佳部位和时机?对于不同程度的心肌损伤采用细胞移植的数量如何量化?啮齿类动物模型能否准确反应人类心脏的状态和移植后的反应?在心血管疾病状态中病理作用下对植入的干细胞的影响?源于植入细胞的新生CMs是否具有完整的功能以及它们的寿命?移植后其分化能力能保持多久?替代组织的功能能维持多久?是否能改善心室重构从而改善心血管疾病的远期预后?如何避免植入干细胞受损,增加干细胞的数量,纠正干细胞的异常?尽管如此,可以预见,随着干细胞研究的深入,应用最近发展的组织工程学技术和干细胞诱导技术,将间充质干细胞诱导分化为心肌细胞,在体外构建组织工程化心肌组织,为心脏外科手术治疗心脏病,提供了一种全新的思路和治疗策略。不久的将来,MSCs的移植将会给心血管疾病的治疗带来巨大变革。
参 考 文 献
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