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【摘要】 目的 研究丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)药物血清是否具有抑制肝星状细胞(HSCs)胞浆游离钙(［Ca2+］i)增高的作用。方法 健康SD大鼠32只,按随机数字表随机分为4组:肝纤维化模型丹参酮ⅡA组(8只) 给予用精制橄榄油配制的 40%CCl4 溶液,9 周后腹腔注射丹参酮ⅡA(15 mg/kg)15 d;肝纤维化模型对照组(8只)给予用精制橄榄油配制的40%CCl4 溶液，9周后灌服生理盐水15 d;正常大鼠丹参酮ⅡA组(8只)仅给予等量精制橄榄油9周,然后腹腔注射丹参酮ⅡA(15 mg/kg)15 d;正常对照组(8只)仅给予等量精制橄榄油，9周后灌服生理盐水15 d。结束后,经下腔静脉取血并分离血清。采用盲法,用上述 10%血清培养 HSCs24 h并负载好 Fluo23PAM后使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测 HSCs［Ca2+］i。结果 ①经正常大鼠丹参酮ⅡA组及肝纤维化模型丹参酮ⅡA组的血清预处理的 HSCs,其［Ca2+］i荧光强度相对值均明显低于肝纤维化模型对照组(P2+］i荧光强度变化百分数显著低于肝纤维化模型对照组(P2+］i的升高,可能是其发挥抗肝纤维化作用的重要途径之一。
大量实验研究表明丹参等活血化瘀药物为主的方法治疗肝纤维化(HF)均取得了较好疗效。肝星状细胞(HSC)是肝内细胞外基质的主要来源，HSCs激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFLC)，是肝纤维化发生、发展的核心环节。各种致纤维化因素均把HSCs作为最终靶细胞，通过使其转化为肌成纤维细胞这一共同复杂的网络系统，参与HF的发生及进展。丹参酮ⅡA为丹参的一种主要组分，有研究表明丹参酮ⅡA对活化的肝星状细胞有明显抑制作用，但其作用机制不详。目前，丹参酮ⅡA临床已经用于心脏、肾脏等纤维化疾病的治疗，且其疗效确切，加之目前丹参酮ⅡA抗肝纤维化的研究成果，提示丹参酮ⅡA在将来的治疗肝纤维化的新的临床应用方面具有良好前景。本实验将在细胞水平和分子水平深入探讨丹参酮ⅡA抗肝纤维化的作用机制，进一步阐明其对肝纤维化时肝星状细胞活化的钙离子信号转导通路的影响和作用。�
1 材料与方法�
1.1 实验动物
雄性清洁级 SD大鼠32只,体质量180～250 g,由河北医科大学实验动物中心提供。动物进行完全随机设计,按随机数字表随机分组如下:A 组为正常对照组(n =8);B 组为正常大鼠丹参酮ⅡA组(n =8);C组为肝纤维化模型对照组(n =8);D 组为肝纤维化模型丹参酮ⅡA组(n =8)。�
1.2 细胞株
肝星状细胞株 CFSC由美国 Greenwel 教授建株并惠赠,其表型为活化的 HSCs,从四氯化碳(CCl��4�)诱发的肝硬化大鼠中分离并通过培养使细胞自发获得永生性,冷冻保存于液氮中。�
1.3 主要仪器
激光共聚焦显微镜购自德国Leica公司。�
1.4 试剂
AngⅡ购自美国 Sigma公司, 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液购自上海市第一生化药业有限公司,RPMI -1640购自美国 Gibco 公司,FLUO-3,AM Ester 及 PluronicF-127均购自美国 Biotium公司,其他试剂均为进口或国产分析纯。�
1.5 液体配制
台氏液(mmol/L) :NaCl 135, KCl 4.0, CaCl��2� 1.0, MgCl��2� 1.0, HEPES 10, glucose10, 用NaOH将pH值调至7.4。�
1.6 药物血清的制备及细胞培养
正常大鼠及CCl�4造模后肝纤维化大鼠进行药物腹腔注射,再分别制备两种不同药物血清进行体外细胞培养。�
1.6.1 动物实验�
1.6.1.1 造模 C、 D组:精制橄榄油配制 40%［ml/L］CCl��4�溶液:每周2次,首次4 ml/kg,以后2 ml/kg,皮下注射,连续9周。A、 B组:精制橄榄油皮下注射,同 CCl��4� 所用方法相同。�
1.6.1.2 药物血清制备 造模成功后,药物组(B、 D组)以每天15 mg/kg剂量腹腔注射;对照组(A、 C组)灌以等体积生理盐水。连续给药15 d后,晚间禁食 12 h,次日按常规量再腹腔注射 1 次,分别于2 h后下腔静脉取血、离心并分离血清,其中有溶血者弃之不用。同组血清合并混匀,56℃，30 min水浴灭活,-70℃保存。�
1.6.2 细胞培养 ①将冷冻保存于液氮中的HSCs复苏后接种于含10%胎牛血清、10��5�U/L青霉素、100 mg/L链霉素、4 mmol/L L-谷氨酰胺及1 mol/L HEPES的10%RPMI-1640培养液(pH7.4)中,37℃、5%CO�2条件下培养。当细胞呈单层致密状时,用0.25%胰蛋白酶消化后以1�∶�3传代,24 h换液,72 h再次传代。每次实验均在呈指数生长的细胞中进行,将2 cm×2 cm盖玻片预先放置在6孔培养板,细胞消化后以1.0×10��7�/L的密度接种2 ml制备爬片,培养箱中孵育至细胞80%融合时,弃培养液,换不含胎牛血清的细胞培养液继续培养24 h,使细胞基本同步化于G��0�期后进行药物血清预处理实验。②药物血清预处理:将上述爬片细胞分为4组,每孔加入10%RPMI-1640培养液900 μl,然后各实验孔采用盲法分别给予已制备好的药物血清或对照组血清100 μl,终浓度为10%,每组设3个复孔。继续培养24 h后进行实验。�
1.7 钙荧光探针的负载
钙荧光探针Fluo-3/AM用纯DMSO配成1 mmol/L的储备液,-20℃避光保存备用。促溶剂F-127溶于DMSO(F-127�∶�DMSO质量比为1�∶�5)室温保存备用。实验前取1 μlFluo-3/AM储备液溶于1 ml台氏液,再加入1 μlF-127,混匀后向培养板中加500 μl Fluo-3/AM,终浓度为1 μmol/L。37℃避光孵育约30 min,吸去负载液,再用台氏液漂洗爬片2～3次,用滤纸尽量吸干盖玻片的液体后,将其放置于倒置显微镜上端的浴槽中,加入500 μl台氏液,待上机检测HSCs［Ca��2+�］��i�。�
1.8 LSCM检测HSCs［Ca��2+�］��i��
1.8.1 测定条件 将负载好的细胞放在LSCM的载物台上,调节焦距使图像达到最清晰,选取活性良好的 HSCs进行实验观察。激发波长488 nm,发射波长 530 nm,40 倍物镜,xyt 扫描方式,在 Time Series程序下开始预扫描,根据细胞对药物反应的预试验结果,扫描时间间隔5 s,用药后观察300 s。该浓度的Fluo-3/AM对细胞形态无影响,细胞核位置正常,细胞内钙荧光强度无明显波动。�
1.8.2 选择 EC��50�实验浓度 本实验预实验分为以下两组(n=8):①对照组: 按AngⅡ各浓度组加药时间顺次向未经药物血清预处理的上述台氏液加入与实验组同等体积的生理盐水。② AngⅡ组(10��-11�、 10��-10�、 10��-9�、 10��-8�、 10��-7�、 10��-6�、 10��-5�mol/L) :从低浓度开始向未经药物血清预处理的上述台氏液顺次加入AngⅡ,据预试验结果,每次加药时间选择在上一浓度AngⅡ作用达峰值时刻,作出浓度累积反应曲线,选择 EC50 (达到最大效应50%时所对应的浓度)作为以后的实验浓度;每个被染色细胞只使用1次,加上述干预前细胞在台式液中需稳定5～10 min。�
1.8.3 LSCM检测 HSCs［Ca��2+�］��i� 将上述经制备的动物血清预处理的细胞负载好 Fluo-3/AM后上机检测,每组相同位置选取8个细胞进行荧光强度分析。�
1.8.4 AngⅡ刺激后LSCM检测 HSCs［Ca��2+�］��i� 将上述经药物血清预处理的细胞及对照组细胞负载好Fluo-3/AM后上机检测,给予AngⅡ(10��-7�mmol/ L)刺激后分析细胞荧光强度变化百分数。�
HSCs胞浆［Ca��2+�］��i� 的计算方法:利用LSCM所配备的计算与图像软件(leica confocal software,TCS SP2),计算荧光强度相对值,荧光强度越大, ［Ca��2+�］��i�越高; ［Ca��2+�］��i�的变化用Fluo-3/AM与 Ca��2+�结合后荧光强度变化百分数表示。�
［Ca��2+�］��i�荧光强度变化百分数(%) = (F-F��0�)/F��0�×100%�
其中 F为LSCM测量时整个细胞的平均荧光强度,F��0� 为用药前的［Ca��2+�］��i� 荧光强度。�
1.9 统计学处理
结果以均值±标准差(x±s)表示,采用 SPSS 10.0软件行单因素方差分析。�
2 结果�
2.1 HSCs的 Ca2+荧光成像 LSCM下 Ca2+成像的 HSCs仍可见普通倒置显微镜下的形态特征,细胞内［Ca��2+�］i 的浓度的高低由细胞被激发出的荧光强弱表示,荧光强度越强表示［Ca��2+�］i 浓度越高,反之则越低。本实验 HSCs与Fluo-3/AM孵育后,所有细胞均被染色,且每组各细胞间的强度基本一致。�
2.2 静息状态下 HSCs［Ca��2+�］��i� 的动态变化
为证明细胞培养液本身对 HSCs［Ca��2+�］��i�的影响,本研究观察了6个 HSCs在实验所需的时间内(5 min) ［Ca��2+�］��i�的动态变化。结果表明,HSCs在实验所需的整个时间内［Ca��2+�］��i� 荧光强度基本保持稳定。�
2.3 不同浓度AngⅡ对 HSCs的累积反应曲线
给予AngⅡ浓度梯度刺激 HSCs后, ［Ca��2+�］��i� 荧光强度逐渐增加,作出累积反应曲线后,得到EC50值约为1.1×10��-7�mol/L。�
2.4 丹参酮ⅡA药物血清对 Ang Ⅱ介导的 HSCs［Ca��2+�］��i�变化的影响
①经正常大鼠丹参酮ⅡA组及肝纤维化模型丹参酮ⅡA组药物血清预处理 HSCs后,其［Ca��2+�］��i�荧光强度相对值均显著低于经肝纤维化模型对照组血清预处理的 HSCs［Ca��2+�］��i� (均为 P[1]。1985年Friedman等[2]首次报道这种贮脂细胞是生成胶原的主要细胞，之后大量研究开始关注其在肝纤维化进程中的作用，并取得很大进展，调控HSCs活化的关键信号通路基本得以阐明。研究发现，在病毒、乙醇等慢性损伤因素作用下，肝细胞、窦内皮细胞、Kupffer细胞、炎症细胞等通过旁分泌途径，激活的HSCs也可通过自分泌途径，产生TGFβ1、血小板衍生生长因子(PDGF)等多种细胞因子，激活HSCs，促进其增殖、合成大量ECM，同时ECM降解减少，以致其在肝内大量沉积，肝纤维化逐渐形成[3]。目前普遍认为，HSCs的活化和增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节[4]。因此，在有效去除病因的基础上，抑制HSCs活化和增殖或诱导其凋亡是目前治疗肝纤维化的主要策略。�
丹参为唇形科鼠尾草属植物的干燥根部,为常用中药,有活血祛瘀，安神宁心，止痛等功效,其药理及临床应用范围较广,已证实丹参能抑制HSCs活化［Ca��2+�］�i的升高[5],其脂溶性部分有效成分丹参酮II��A�已被证明具有抗氧化性、抗急性肝损伤和抗肝纤维化等作用[6-8]。在细胞内Ca��2+�浓度的增加是细胞增殖分裂不可缺少的条件。在HSCs活化过程中,其胞质内的［Ca��2+�］�i是许多生长因子、细胞因子及氧化应激产物等发挥促生长和增殖作用的主要递质之一。本实验研究丹参酮II��A�是否能够通过抑制HSCs活化［Ca��2+�］�i的升高，发挥抗肝纤维化作用。����
Batller用体外研究��125�I AngⅡ结合试验表明, 激活的人HSCs有大量血管紧张素 Ⅱ1型受体 (AT1) 的表达[9]。提示激活的 HSCs是肝内脉管系统 AngⅡ的重要靶器官。AngⅡ作用于 HSCs的 AT1受体, 可引起细胞内钙明显增加, 进而经过ERK等途径作用于转录因子 AP-1等, 最终引起 HSCs活化与增殖。本实验结果显示, 给予 Ang Ⅱ 刺激后, 经两种丹参酮IIA药物血清预处理的 HSCs其 ［Ca��2+�］ �i荧光强度变化百分数明显低于病理模型对照组及正常对照组, 提示丹参酮IIA阻断或抑制了 HSCs的 Ang -Ⅱ信号转导通路, 从而抑制 HSCs的活化与增殖。�
本实验结果表明,经正常大鼠及肝纤维化大鼠分别制备的两种丹参酮IIA药物血清预处理后,其钙荧光强度均明显低于肝纤维化模型对照组及正常对照组,显示两种丹参酮IIA药物血清均显著抑制了HSCs细胞内钙的升高。该结果提示, 丹参酮IIA可能通过抑制HSCs［Ca��2+�］�i的升高,从而抑制的HSCs活化与增殖,此可能是其发挥抗肝纤维化作用的重要途径之一。当然, HSCs的活化增殖是由极其复杂的信号转导网络所调控,关于丹参酮IIA抑制钙动员的作用机制尚需进一步深入研究。�
参 考 文 献�
［1］ Friedman SL. Hepatic stellate cells. Prog Liver Dis, 1996, 14:101-130.�
［2］ Friedman SL, Roll FJ, Boyles J, et al. Hepatic lipocytes: the principal collagen-producing cells of normal rat liver. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985, 82(24):8681-8685.�
［3］ Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem, 2000, 275(4):2247-2250.�
［4］ Friedman SL. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev, 2008, 88(1):125-172.�
［5］ 王军民，姚希贤，杨书良. 丹参对AngII刺激鼠HSCs活化Ca��2+�效应抑制作用的随机对照试验.第三军医大学学报，2001，27(8)：756-759.�
［6］ 刘永刚,陈厚昌,蒋毅萍.丹参酮II��A�对小鼠肝损伤的保护作用.中药材,2001,24(8):588.�
［7］ 曹恩华,刘晓麒,李景福,等.天然抗氧化剂丹参酮II��A�对肝细胞脂质过氧化产物与DNA相互作用的影响.生物物理学报,1996, 12(2):339.�
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［9］ Bataller R, Gines P, Nicolas J M, et al. Angi otensin Ⅱinduces con2tracti on and p roliferation of human hepatic stellate cells. Gastr oen2ter ology, 2000, 118: 1149-1156.
