【www.zhangdahai.com--共青团公文】
[摘要] 目的应用双重免疫组化染色法，研究P53与细胞角蛋白在鼻咽癌中的表达。方法50例鼻咽部低分化鳞癌组织，P53单克隆抗体，CK多克隆抗体，双重免疫组化染色。结果50例鼻咽部低分化鳞癌组织标本均有不同数量的双标记阳性细胞，即P53与CK同时表达。结论双重免疫组化染色法，可用于研究P53与细胞角蛋白在鼻咽癌中的表达。
[关键词]双重免疫组化染色法；鼻咽癌；P53；细胞角蛋白
[中图分类号]739．6
[文献标识码]A
[文章编号] 1673-755512007]02-5-02
双重染色法是在一张切片上做两种不同染色的方法，如免疫组化和免疫组化、免疫组化和原位杂交、免疫组化和特殊染色等。其中双重免疫组化染色是在同一张切片上显示两种不同抗原的免疫组化染色方法，这种方法可以了解不同细胞、组织之间的相互关系，甚至可以了解同一种细胞内抗原之间的相互关系。本实验运用双重免疫组化染色法，在一张切片上同时显示鼻咽部低分化鳞癌组织P53与细胞角蛋白(cytokeratin，CK)，用以观察CK阳性的癌细胞是否同时表达P53。
1材料和方法
1．1材料50例鼻咽部低分化鳞癌组织，选自郑州大学三附院病理科2004年1月～2006年1月标本。
1．2方法
1．2．1 P53单克隆抗体，CK多克隆抗体，双重免疫组化染色试剂盒，均为美国Maxim公司产品。预实验中将同一组织连续切片4张，分别先后进行P53、CK染色，其中每种染色都分别使用不同的显色方法，如链霉菌抗生物素―碱性磷酸酶，用5―溴-4-氯―3吲哚磷酸盐／氯化硝基四氮唑蓝(BCIP／NBT)显色，呈紫黑色；而链霉菌抗生物素―过氧化物酶，则用3―氨基-9-乙基卡唑(AEC)显色，呈橙红色；最后根据着色情况，将着色深的P53(BCIP／NBT显色)定为首先显色的一抗。
1．2．2双重染色过程(1)石蜡切片脱蜡水化；(2)过氧化酶阻断溶液10min，PBS洗；(3)非免疫性动物血清10min，PBS洗；(4)一抗PCNA 60min，PBS洗；(5)生物素标记的二抗10min，PBS洗；(6)链霉菌抗生物素―碱性磷酸酶溶液10min，PBS洗；(7)BCIP／NBT，显微镜下观察10～30min，阳性显色为紫黑色,PBS洗；(8)双染增强液10min，PBS洗；(9)重复(3)；(10)一抗GFAP 60min，PBS洗；(11)重复(5)；(12)链霉菌抗生物素―过氧化物酶溶液10min，PBS洗；(13)新鲜配制的AEC显微镜下观察5～10min，阳性显色为橙红色；(14)自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，水性封片剂封片，显微镜观察。
2结果
鼻咽部低分化鳞癌组织胞核着紫黑色为P53阳性，胞浆着橙红色为CK阳性，双标记阳性者同一细胞中核呈紫黑色，胞浆呈橙红色，即P53与CK同时表达，50例标本均有不同数量的双标记阳性细胞。
3讨论
3．1免疫组化双重染色法，提供了纯亲和力的生物素化二抗，与链霉菌抗生物素―碱性磷酸酶及链霉菌抗生物素―过氧化物酶相结合。使用不同的一抗，因着色部位不同，不影响诊断。双染增强剂的应用也提高了第二次染色的敏感性和特异性，并可明显降低背景着色。
3．2在选择双重染色的一抗时，应避免两种一抗的定位(胞核、胞浆、胞膜)重复，如两者都是在胞浆或胞膜上显色，结果后一种显色会将前一种显色覆盖，实验结果不能区分。
3．3所选的两种一抗的预处理方法(高温抗原修复、酶消化等)应完全相同，以保证两种抗原都得到良好的暴露。我们在预实验中尝试了PCNA和CK的双重染色，由于CK需要高温修复，而PCNA不需要，实验无法继续。本实验的P53和CK均需高温修复，实验结果理想。
3．4双染要注意显色方法的合理搭配，双重染色中显色系统的选择应注意染色对比度，选择两种颜色差别明显的显色剂，以利于观察。P53用BCIP/NBT显色，阳性为胞核紫黑色；CK用AEC显色，阳性为胞浆橙红色，对比明显，容易判断。
3．5在进行双重染色之前，必须首先做单独染色的预实验。其实验条件必须与双染时的条件相同，观察实验结果，抗体定位正确后，再确定2种抗体使用的顺序，进行双染实验。我们在预实验中，分别用一种染色，二种底物显色进行对比。如先显示AEC,AEC经BCIP／NBT作用后可转变为灰黑色，易与BCIP／NBT的紫黑色产物相混淆，降低对比度。而即使第二种显色时用AEC，它也会去掉BC IP／NBT的部分染色，严重时会全部去掉，所以我们将易着BCIP/NBT显色并着色较深的P53首先显色，着色较浅的CK其后显色。而且BCIP／NBT显色一定要充分，时间可在30rain，因为第一重染色后的显色经过酸性增强液的作用和反复冲洗后会变淡。
3．6双重染色步骤多，特别是P53与CK均要求高温抗原修复，防脱片也很重要，应用10％的多聚赖氨酸处理载玻片，操作过程动作轻柔，这样可有效地防止脱片。
